大鰭鳠IL-1β基因cDNA克隆及表達(dá)分析.pdf

1、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)是白細(xì)胞介素1家族的重要成員之一。IL-1β作為一類促炎反應(yīng)的前期細(xì)胞因子,通過(guò)介導(dǎo)一系列反應(yīng)而誘發(fā)炎癥,同時(shí)還具有提高組織抗感染的能力。研究表明多種刺激因素都可導(dǎo)致魚類IL-1β的表達(dá)量發(fā)生變化,這預(yù)示著IL-1β可能在魚類抵御疾病的生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。大鰭鳠(Mystus macropterus)作為長(zhǎng)江及珠江流域特有的經(jīng)濟(jì)魚類,在養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)常受病原菌感染而發(fā)生死亡。因

2、此,探討IL-1β基因在大鰭鳠抗病反應(yīng)中表達(dá)量的變化,以期進(jìn)一步闡明IL-1β基因在魚類抗病過(guò)程中的作用。本研究采用簡(jiǎn)并引物PCR、RACE和巢氏PCR法,克隆了大鰭鳠的IL-1β cDNA的基因序列。在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用半定量PCR方法,研究了大鰭鳠在未受刺激的情況下IL-1β基因的組織分布,以及在經(jīng)嗜水氣單胞菌(Aeromona hydrophila)和脂多糖(LPS)刺激后,IL-1β基因的表達(dá)變化規(guī)律。主要結(jié)果如下:
　　

3、大鰭鳠IL-1β基因cDNA全長(zhǎng)1194bp(GenBank登錄號(hào):JN646749),3'非編碼區(qū)域(UTR)為224bp,其中含有3個(gè)RNA不穩(wěn)定基序ATTTA(RNA instabilitymotifs),同時(shí)還含有30個(gè)堿基的poly(A)尾,在poly(A)尾上游17bp處可見poly(A)加尾信號(hào)AATAAA。5'UTR為82bp,開放閱讀框(ORF)為888bp,編碼296個(gè)氨基酸。對(duì)克隆到的序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子

4、量為33.84343kD,等電點(diǎn)為5.00。存在IL-1家族的標(biāo)簽序列FESVRYPGWFITTSKDDFKPV。發(fā)現(xiàn)大鰭鳠IL-1β序列中不存在信號(hào)肽和白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)換酶(interleukin-1 conveting enzyme,ICE)的切割位點(diǎn)。與斑點(diǎn)叉尾鮰等其他8種脊椎動(dòng)物進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn),大鰭鳠IL-1β氨基酸序列與斑點(diǎn)叉尾鮰相似性最高,為79.0%,與原雞的相似性最低,為22.0%。進(jìn)化樹分析表明,大鰭鳠IL-1β與

5、斑點(diǎn)叉尾鮰聚為一支。
　　 組織分布分析表明,IL-1β基因在大鰭鳠各檢測(cè)組織器官中呈組成型表達(dá),在頭腎、脾臟中表達(dá)量最高,在腎、肌肉、胃、皮膚、肝臟及腸中的表達(dá)量次之,而在腦中表達(dá)量最弱。
　　 經(jīng)嗜水氣單胞菌刺激后,大鰭鳠頭腎和脾臟中IL-1β基因的表達(dá)量變化的總體趨勢(shì)相近,都是隨時(shí)間先升高再下降至正常水平。注射嗜水氣單胞菌4h后頭腎和脾臟中的表達(dá)量均開始明顯增加,1d后表達(dá)量達(dá)到最高,隨后表達(dá)量開始有所降低,15d

6、后恢復(fù)到未刺激的水平。
　　 經(jīng)LPS刺激后,大鰭鳠IL-1β的表達(dá)量變化較嗜水氣單胞菌刺激更為敏感,頭腎和脾臟的表達(dá)量總體趨勢(shì)都表現(xiàn)為先快速增加,后隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸恢復(fù)至對(duì)照水平。注射LPS2h后頭腎和脾臟中的表達(dá)量均開始明顯增加,4h后表達(dá)量達(dá)到最高,隨后表達(dá)量開始下降,1d時(shí)表達(dá)量較4h時(shí)的稍有下降,3d時(shí)的表達(dá)量較1d時(shí)的已有大幅度下降,7d時(shí)的表達(dá)量恢復(fù)到刺激前的水平。
　　 結(jié)果表明大鰭鳠IL-1β基