中華鱉腸道益生菌的篩選與應(yīng)用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)從中華鱉(Trionyxsinensis)腸道內(nèi)分離出了對中華鱉常見致病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的潛在益生菌，對篩選出來的益生菌的特性進(jìn)行檢測和研究，并進(jìn)一步研究了在飼料中添加該益生菌對中華鱉生長、免疫的影響，為中華鱉養(yǎng)殖行業(yè)中益生菌的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　(1)通過點(diǎn)種法初篩和牛津杯法復(fù)篩，從中華鱉腸道篩選到1株對嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、溫和氣單胞菌(A.sobria)以及豚鼠

2、氣單胞菌（A.caviae）具有拮抗作用的菌株Dec-43。對該菌株進(jìn)行形態(tài)及生理生化特征分析，結(jié)果與屎腸球菌的生理生化特征一致;提取細(xì)菌基因組DNA，通過16SrRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該菌株的16SrRNA基因克隆到了一個長度為1448pb的片段，經(jīng)測序和序列比對，該片段與Genbank中屎腸球菌的序列相似性達(dá)99％，因此，該菌株確定為屎腸球菌（Enterococcusfaecium）。通過單因素試驗(yàn)確定了該菌株的最佳生長

3、溫度、鹽度、初始pH、接種量分別為36℃，鹽度0.6％，培養(yǎng)基初始pH值7，接種量10％;通過正交試驗(yàn)，確定了培養(yǎng)基中碳源（葡萄糖）、氮源（蛋白胨）最適含量分別為15g/L和10g/L。
　　(2)將中華鱉隨機(jī)分成四組，分別投喂基礎(chǔ)飼料(C)，添加106cfu/g(E1)、107cfu/g(E2)和108cfu/g(E3)濃度Dec-43的基礎(chǔ)飼料，飼喂56d后發(fā)現(xiàn):三個實(shí)驗(yàn)組(E1、E2、E3)的特定生長率顯著高于對照組(P＜0

4、.05)，實(shí)驗(yàn)組2(E2)的相對增重率顯著高于對照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組比對照組的中華鱉的血液白細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、髓過氧化物酶活性以及補(bǔ)體C3、C4表現(xiàn)出不同程度的升高。該結(jié)果表明，菌株Dec-43對中華鱉生長及免疫功能具有促進(jìn)作用。
　　(3)當(dāng)中華鱉飼養(yǎng)56d后，每組分別注射嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)和生理鹽水，并檢測肝臟、脾臟、腎臟和腸道組織在不同時間點(diǎn)(12、24、36、48、60、72h)A

5、TF4基因和CD9基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，肝臟中，E2實(shí)驗(yàn)組ATF4基因的表達(dá)量在24h和48h的表達(dá)量顯著低于對照組，只有在36h高于對照組;脾臟中，E1實(shí)驗(yàn)組ATF4基因的表達(dá)量在12、36、48、60h均顯著高于對照組;腎臟中，E1實(shí)驗(yàn)組ATF4基因的表達(dá)量比對照組表達(dá)量先達(dá)到最大值，也先下降;腸道中，E1實(shí)驗(yàn)組ATF4基因的表達(dá)量在12到48h的表達(dá)量均低于對照組，其他時間與對照組無顯著差異性;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，投喂Dec-43后，

6、能降低肝臟和腸道中炎癥反應(yīng)，促使腎臟迅速對細(xì)菌感染發(fā)生免疫反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體迅速恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，同時也能提高脾臟的免疫應(yīng)答，及時清除外界病原菌。肝臟中，E3實(shí)驗(yàn)組CD9基因的表達(dá)量在12h顯著高于對照組，24h顯著低于對照組，其后下降到與對照組無顯著性差異;脾臟中，E1實(shí)驗(yàn)組CD9基因的表達(dá)量在12h顯著高于對照組，其后與對照組無顯著差異性，并且在72h時顯著低于對照組;在腎臟中，實(shí)驗(yàn)組E1、E2、E3的CD9基因表達(dá)量，在除60h以外的時間點(diǎn)，

7、均顯著高于對照組;在腸道組織中，E1實(shí)驗(yàn)組只在48h時，CD9的表達(dá)量顯著高于對照組，在60h時與對照組無顯著差異性，其他時間點(diǎn)均顯著低于對照組，E2實(shí)驗(yàn)組在48h和60h顯著高于對照組，其他時間顯著低于或與對照組無顯著差異，E3實(shí)驗(yàn)組只在48h顯著高于對照組，在12、36h時顯著低于對照組，其他時間點(diǎn)與對照組無顯著差異性;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，投喂Dec-43后，能加快肝臟和脾臟對外界病原菌反應(yīng)，加快機(jī)體恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，同時也能促進(jìn)腎臟中T細(xì)胞的活