IGFBP7在鮑幼蟲(chóng)附著變態(tài)和成體免疫過(guò)程的作用研究.pdf

1、橐萎夫?qū)W碩士學(xué)位論文I G F B P 7 在鮑幼蟲(chóng)附著變態(tài)和成體免疫過(guò)程的作用研究l G F B P 7 e f f e c t s o nI a r v a Is e t t l e m e n t a n dm e t a m o r p h o s i s a n d a d u l t i m m u n o r e a c t i o n s i nt h e s m a l Ia b a l o n e H a l i o

2、 t i s d i v e r s i c o l o rI G F B P 7 在鮑幼蟲(chóng)附著變態(tài)和成體免疫過(guò)程的作用研究摘 要雜色鮑是我國(guó)南方沿海各省重要的海水養(yǎng)殖貝類，因其幼蟲(chóng)營(yíng)卵黃營(yíng)養(yǎng)，能夠快速的經(jīng)歷浮游和附著底棲的兩相變態(tài)生活史，是研究貝類乃至海洋無(wú)脊椎動(dòng)物變態(tài)現(xiàn)象的理想模式物種。盡管已有海洋貝類變態(tài)過(guò)程的幾個(gè)信號(hào)通路被提出，但對(duì)于調(diào)節(jié)這一復(fù)雜過(guò)程的分子機(jī)制所知仍然有限。因此，通過(guò)分子生物學(xué)方法篩選和分析雜色鮑幼蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育相關(guān)

3、基因，將可為進(jìn)一步闡明雜色鮑乃至貝類的變態(tài)發(fā)育的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的雜色鮑E S T 數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上篩選獲得胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7 ( i n s u l i n ．1 i k eg r o w t hf a c t o rb i n d i n gp r o t e i n 7 ，I G F B P 7 ) 基因片段，并采用S M A R T - R A C E技術(shù)成功克隆得到雜色鮑I G F B P 7 基

4、因全長(zhǎng)c D N A 序列，命名為s a l G F B P 7 ，并采用實(shí)時(shí)定量P C R ( q R T - P C R ) 、原位雜交、免疫組化、W e s t e r nb l o t 、基因沉默和基因過(guò)表達(dá)等技術(shù)分析s a l G F B P 7 基因在雜色鮑幼蟲(chóng)附著變態(tài)及成體免疫和血細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)過(guò)程中的作用。主要的研究結(jié)果如下：1 ) s a l G F B P 7c D N A 全長(zhǎng)為1 8 1 2b p ，編碼2 3 9

5、 個(gè)氨基酸，包含I B 功能結(jié)構(gòu)域，Ⅺ功能結(jié)構(gòu)域和I g C 2 功能結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)的氨基酸序列中包含X C G C C X X C 和C G X D X X T Y 刪兩個(gè)保守基序，1 - 8 個(gè)保守半胱氨酸殘基，2 個(gè)糖基化位點(diǎn)，1 1 個(gè)磷酸化位點(diǎn)。2 ) q R T - P C R 顯示，s a l G F B P 7m R N A 在雜色鮑各組織中均有表達(dá)，在血淋巴中表達(dá)量最高，其次是鰓，兩者均極顯著高于其他組織( P <

6、 0 ．0 1 ) 。W e s t e mb l o t 結(jié)果也顯示s a I G F B P 7 蛋白在雜色鮑各組織中均有分布。3 ) 原位雜交分析了s a l G F B P 7 基因在雜色鮑血細(xì)胞和鰓中的定位表達(dá)情況，結(jié)果顯示，s a l G F B P 7m R N A 在血細(xì)胞核和鰓上皮細(xì)胞中雜交信號(hào)最強(qiáng)。免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步顯示，s a l G F B P 7 蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要分布于鰓上皮的杯狀分泌細(xì)胞中。4 ) 副溶血

7、弧菌感染后，血淋巴中s a l G F B P 7m R N A 的表達(dá)量在第6 h 和第1 2 h 迅速顯著上調(diào)( 氏O ．0 5 ) ，鰓中s a l G F B P 7 m R N A 的表達(dá)量在第3 h 顯著上調(diào)( P < 0 ．0 5 ) 。W e s t e r n b l o t結(jié)果進(jìn)一步顯示，鰓s a l G F B P 7 蛋白在感染3 h 有強(qiáng)烈的表達(dá)( 尸< 0 ．0 5 ) 。5 ) q R T -

8、P C R 結(jié)果顯示s a l G F B P 7m R N A 在胚胎發(fā)育早期階段幾乎沒(méi)有表達(dá)，從擔(dān)輪幼蟲(chóng)早期開(kāi)始，隨著胚胎和幼蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育表達(dá)量呈極顯著上調(diào)趨勢(shì)( 尸< 0 ．0 1 ) 。原位雜交結(jié)果顯示，在雜色鮑變態(tài)發(fā)育過(guò)程中，s a l G F B P 7m R N A 的雜交信號(hào)主要集中于包含大量神經(jīng)節(jié)的頭部和足部。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，免疫陽(yáng)性信號(hào)主要分布于發(fā)育中的頭部和足部區(qū)域，尤其是在纖毛環(huán)區(qū)域陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)。6

9、) s a l G F B P 7 d s R N A 干擾即將附著的感受態(tài)幼蟲(chóng)結(jié)果顯示，R N A i 實(shí)驗(yàn)組和添加胰島素處理組的附著率與未處理組的附著率相比分別極顯著降低了3 1 ．8 1 ％和6 1 ．3 3 ％( P < 0 ．0 1 ) 。7 ) q R T - P C R 檢測(cè)R N A 干擾效果顯示，R N A 干擾后s a l G F B P 7 基因表達(dá)量極顯著降低( 尸< 0 ．0 1 ) ，胚胎整體原位