羅非魚分子標(biāo)記開發(fā)和C1抑制因子克隆.pdf

1、羅非魚(Tilapias)是重要的世界性經(jīng)濟(jì)魚類,具有優(yōu)良的養(yǎng)殖性能,隸屬于麗鯛科(Cichlidae)。由于麗鯛科魚類具有豐富的形態(tài)、行為和生態(tài)多樣性,目前已被視為研究生物進(jìn)化的重要模式魚類。本文針對羅非魚遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)研究分子標(biāo)記不夠豐富、養(yǎng)殖過程中病害開始暴發(fā)的實(shí)際情況,開展了二種羅非魚(尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚)的通用性微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)、三種羅非魚(尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚和薩羅羅非魚)線粒體基因組全序列測定,以及免疫功能基因

2、-補(bǔ)體1抑制因子(C1INH)的克隆和表達(dá)分析,旨在為羅非魚的遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)理論研究提供相關(guān)分析工具,為羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:
　　1、羅非魚分子標(biāo)記開發(fā)Ⅰ:三種羅非魚的粒體DNA全序列測定
　　麗鯛科魚類在進(jìn)化生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中扮演著重要的角色。尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)、奧利亞羅非魚(Oreochromis aureus)、薩羅羅非魚(Sarotherod

3、on melanotheron)、莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus)不僅具有廣泛的養(yǎng)殖基礎(chǔ)和養(yǎng)殖前景,表現(xiàn)出優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)利用價值,而且也是研究麗鯛科魚類進(jìn)化生物學(xué)方面的模式生物,具有重要的學(xué)術(shù)研究價值。在本研究中,對尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚和薩羅羅非魚三種羅非魚的線粒體DNA全序列進(jìn)行了測定,并用線粒體蛋白編碼基因探討了它們在麗鯛科中的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn):尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚與薩羅羅非魚線粒體DNA的

4、序列長度分別是16,628bp、16,625bp和16,627bp,它們在結(jié)構(gòu)上與其他麗鯛科魚類線粒體DNA結(jié)構(gòu)一樣,包括13個蛋白編碼基因、2個rRNA基因、22個 tRNA基因和1個結(jié)構(gòu)調(diào)控區(qū)。采用三種不同的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建方法(最大簡約法、最大似然法和貝葉斯法)進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果表明:尼羅羅非魚與莫桑比克羅非魚關(guān)系較近,而奧利亞羅非魚與前兩者的關(guān)系較遠(yuǎn)。本部分為羅非魚的遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)等方面的研究提供了線粒體DNA分子標(biāo)記。

5、
　　2、羅非魚分子標(biāo)記開發(fā)Ⅱ:尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚通用性微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)
　　尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交種是當(dāng)前羅非魚養(yǎng)殖中的主要對象,它們的遺傳評估和種質(zhì)鑒定等需要較為豐富的分子標(biāo)記。國外對尼羅羅非魚的微衛(wèi)星(SSR)分子標(biāo)記進(jìn)行了開發(fā),但很少評估這些標(biāo)記在不同種間羅非魚的通用性。本文以尼羅羅非魚DNA為基礎(chǔ)開發(fā)SSR標(biāo)記,共挑選了256個陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證,對其中的207個克隆進(jìn)行了測序,發(fā)現(xiàn)159個克隆具

6、有微衛(wèi)星重復(fù)序列,共設(shè)計了96對羅非魚微衛(wèi)星引物。以31個非洲尼羅羅非魚野生群體和25個奧利亞羅非魚野生群體進(jìn)行了擴(kuò)增驗(yàn)證,篩選通用性的SSR標(biāo)記,最終獲得27對具有較高多態(tài)性的通用性引物。27個引物在尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚群體中的平均等位基因數(shù)分別為5.78和5.04;平均觀察雜合度分別為0.6022和0.4199,平均期望雜合度分別為0.7436和0.5928。尼羅羅非魚群體中偏離哈代-溫柏格平衡的位點(diǎn)有4個(P<0.05),奧利

7、亞羅非魚中為7個。本部分為羅非魚的種質(zhì)評估和群體遺傳學(xué)研究積累了微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
　　3、尼羅羅非魚C1INH基因克隆與表達(dá)分析
　　羅非魚(tilapia)是現(xiàn)在養(yǎng)殖魚類中病害較少的種類之一,然而近年來隨著高密度養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展,羅非魚疾病發(fā)生的幾率大大增加。研究人員希望通過開發(fā)羅非魚用疫苗和對其免疫系統(tǒng)的研究來探討羅非魚的病害問題。補(bǔ)體系統(tǒng)(complement system)是免疫系統(tǒng)之一,它由一系列蛋白質(zhì)分子組成,它能

8、參與破壞或清除那些與抗體結(jié)合的抗原,包括與抗體結(jié)合的細(xì)胞。本章對補(bǔ)體分子之一 C1抑制因子(Complement1 inhibitor，C1INH)基因進(jìn)行了克隆和組織表達(dá)差異分析。
　　利用相近物種的保守區(qū)設(shè)計引物,擴(kuò)增出尼羅羅非魚C1INH基因部分序列,然后利用3’RACE和5’RACE技術(shù)擴(kuò)增出全長序列。通過擴(kuò)增,尼羅羅非魚C1INH基因的cDNA全長為2,128bp,5’UTR長度為101bp、3’UTR長度為236bp、