兩個(gè)養(yǎng)殖海區(qū)及櫛孔扇貝消化盲囊細(xì)菌群落多樣性分析.pdf

1、細(xì)菌是海區(qū)生態(tài)環(huán)境的重要組成部分,本研究為了解單一養(yǎng)殖模式與貝藻混養(yǎng)模式下的扇貝養(yǎng)殖海區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化以及不同模式下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的異同,運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)對沙子口和桑溝灣2種不同養(yǎng)殖模式海區(qū)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了分析。連續(xù)7個(gè)月(2009年5～11月)和11個(gè)月(2009年5月～20lO年4月,2月除外)分別定點(diǎn)采集桑溝灣和沙子口養(yǎng)殖海區(qū)水深0.5m和3m處的水樣,過濾收集粒徑在0.22～3μm的微生物,采用CTAB-

2、法提取樣品總DNA,擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3～V5可變區(qū)序列,并通過變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)對所得序列進(jìn)行分離,采用軟件Quantity One和SensiAnsys進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1)桑溝灣海區(qū)DGGE圖譜共得到231條條帶,其中處于不同位置的條帶數(shù)為26條,每個(gè)月份條帶數(shù)在14～23之間,平均數(shù)為19

3、.41。同一月份水深0.5 m和3m處的細(xì)菌群落組成極為相似(73％～91％),不同月份間的細(xì)菌群落差異較大,其中8月份細(xì)菌種類最為豐富?；诟髟路軩GGE條帶數(shù)目和亮度進(jìn)行UPGMA聚類分析,7個(gè)月份的樣品中,6、7和11月聚為一類,8、9和10月聚為一類,5月單獨(dú)聚為一支。對DGGE圖譜中的11條主帶進(jìn)行回收、重?cái)U(kuò)增和測序,結(jié)果表明,這11條序列與GenBank中已登錄的細(xì)菌物種同源性在91％～99％之間,同源性分析結(jié)果表明這些序列

4、中,α-變形菌亞門(α-Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Aetinobacteria)均占所測序列的27.3％,β-變形菌亞門和γ-變形菌亞門各占9.1％。所分析的11條序列中有10條序列與GenBank中登錄的未成功培養(yǎng)細(xì)菌的序列相似度高。
　　 2)沙子口11個(gè)水深0.5 m處細(xì)菌樣品(2月除外)的DGGE圖譜共得到198條條帶,其中處于不同位置的條帶數(shù)為36條,每個(gè)月份條帶

5、數(shù)在15～23之間,平均數(shù)為18。其中1月份條帶數(shù)最多,3月份條帶數(shù)最少。UPGMA分析顯示,11個(gè)月份的樣品中,春季(3～5月)聚為一大類,夏季到冬季(6～1月)聚為另一大類。對20條熒光強(qiáng)度較高的條帶進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)所有序列與數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列的最大相似性在94％～100％之間。獲得的20條序列分屬于4個(gè)門,其中α-變形菌亞門占所測序列的35％,β-變形菌亞門和γ-變形菌亞門均占10％,擬桿菌門占25％,放線菌門占15％,疣

6、微菌門(Verrucomicrobia)僅占5％。比對結(jié)果顯示,20條序列中16條屬于海洋未培養(yǎng)的細(xì)菌克隆。
　　 3)為分析櫛孔扇貝消化盲囊內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的周年動(dòng)態(tài)變化,本研究于2009年6月～2010年6月連續(xù)12個(gè)月每月采集沙子口養(yǎng)殖區(qū)扇貝10只,擴(kuò)增消化盲囊細(xì)菌的16S rDNA V3～V5可變區(qū)序列,并通過PCR-DGGE技術(shù)對所得序列進(jìn)行分離,采用軟件Quantity One對12個(gè)樣品的DGGE圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果共

7、得到11條不同位置的條帶,各個(gè)月份的條帶數(shù)目相似,其中9條條帶作為共有條帶在全年均有分布,占總條帶數(shù)的81.82％。表明櫛孔扇貝消化盲囊群落結(jié)構(gòu)組成相對穩(wěn)定。選取其中9條熒光強(qiáng)度較高的條帶進(jìn)行測序,所測序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)16SrDNA序列的最大相似性在97％～99％之間,分屬于變形菌門、放線菌門、厚壁菌門(Firmicutes)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)。其中,β-變形菌亞門占所測序列的11.11％,δ-變形菌亞門

8、占22.22％,厚壁菌門占22.22％,藍(lán)細(xì)菌門占11.11％,放線菌門占33.33％。
　　 4)平板培養(yǎng)方法從健康扇貝消化盲囊中分離到28株菌,經(jīng)16S鑒定主要分屬于弧菌屬(Vibrio),23株;Tenacibaculum屬,3株;Colwellia屬,1株;Ruegeria屬,1株。選擇其中分屬不同屬的3株菌(E8:Vibrio,E14:Ruegeria,E19:Tenacibaculum)進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn),每只注射1.7×

9、106個(gè)細(xì)菌,以注射無菌生理鹽水組做對照。分別在感染后的第1d,3d,5d,7d,9d取樣,測定血清中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力,并記錄死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射菌E8(Vibrio)的扇貝10天后的平均死亡率達(dá)到了26.25％,顯著高于對照(5％),注射E14菌株扇貝死亡率則稍低于對照,注射E19菌株,扇貝死亡率稍高于對照。注射菌E8組試驗(yàn)扇貝血清ACP活力先逐漸下降,然后急劇上升,而SOD