慢病毒介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)基因羊鑒定方法的優(yōu)化及卵巢注射慢病毒母羊安全性初步檢測.pdf

1、從Jaenisch通過對(duì)小鼠囊胚注射SV40DNA，構(gòu)建了整合有SV40DNA的小鼠開始，到現(xiàn)在利用重組慢病毒載體跟同源重組技術(shù)構(gòu)建各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，越來越多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被制造出來。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建必然伴隨著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定，雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定技術(shù)沒有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建技術(shù)一般突飛猛進(jìn)，但是，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)也在向著更快、更可靠、更簡便、更便宜的方向發(fā)展著。
　　 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的不斷出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品陸續(xù)的商業(yè)

2、化，轉(zhuǎn)基因逐漸在從實(shí)驗(yàn)室走向大家的生活中。但是，轉(zhuǎn)基因生物的安全性，特別是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全問題一直是社會(huì)廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)，也是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品能否實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題，建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)體系有利于加快人們對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的認(rèn)可度。
　　 本研究應(yīng)用PCR、Southern Blot、基因測序以及血常規(guī)檢測等技術(shù)，在DNA水平對(duì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的慢病毒介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)基因羊進(jìn)行了鑒定并建立了一種對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高的檢測方法。并且，對(duì)卵巢

3、注射有慢病毒的母羊做了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全性檢測，證明了外源基因并沒有在母羊體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而且慢病毒載體對(duì)母羊的健康也沒有造成影響。
　　 本研究內(nèi)容包括以下兩個(gè)部分：
　　 1.慢病毒介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)基因羊的鑒定與鑒定方法建立
　　 針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室之前通過原核顯微注射將MSTN及INHA基因慢病毒RNAi載體注射到羊的受精卵中，并將這些受精卵在體外培養(yǎng)48h后，移植到受體母羊中，最后得到了18頭小羊。提取小羊的組織DN

4、A，在DNA水平通過PCR技術(shù)與SouthernBlot技術(shù)對(duì)這批小羊進(jìn)行了慢病毒上的BSD基因的特異性轉(zhuǎn)基因鑒定，雖然得到的最終結(jié)果為沒有轉(zhuǎn)基因羊出生。但是，通對(duì)這批小羊進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定，在本實(shí)驗(yàn)室建立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定技術(shù)平臺(tái)，并利用地高辛試劑盒對(duì)Southern Blot技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了改進(jìn)，即將200mA電轉(zhuǎn)系統(tǒng)引入DNA的轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)中，證明電轉(zhuǎn)8h可以有效的將瓊脂糖凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，12h后可以完全轉(zhuǎn)移

5、。且在不影響實(shí)驗(yàn)可靠性與靈敏度的情況下，利用實(shí)驗(yàn)室常用儀器恒溫?fù)u床與烘箱進(jìn)行適當(dāng)?shù)目販嘏c時(shí)間調(diào)節(jié)代替了水浴搖床與紫外交聯(lián)雜交儀完成實(shí)驗(yàn)，降低了該實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求，建立了對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求低，操作簡便，可靠性高的慢病毒介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定方法。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功的在本實(shí)驗(yàn)室建立慢病毒介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)基因羊檢測技術(shù)平臺(tái)，并且對(duì)Southern Blot進(jìn)行改進(jìn)，在不影響實(shí)驗(yàn)效果的情況下，利用簡單、常用儀器代替了昂貴、復(fù)雜的儀

6、器，并將200mA電轉(zhuǎn)系統(tǒng)引入DNA的轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)，使得該技術(shù)更易操作，實(shí)驗(yàn)要求降低。
　　 2.卵巢注射慢病毒載體的母羊的安全性檢測
　　 本實(shí)驗(yàn)對(duì)母羊的兩側(cè)卵巢注射了0.25mL慢病毒培養(yǎng)液，6個(gè)月后采母羊頸靜脈，將新鮮血液進(jìn)行血常規(guī)檢測并提取血液組織DNA，旨在檢測注射慢病毒載體的母羊特異性基因BSD基因的整合情況，了解注射慢病毒載體的轉(zhuǎn)基因母羊的安全性。血常規(guī)檢測結(jié)果為實(shí)驗(yàn)組母在白細(xì)胞數(shù)，紅細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)差異并不顯著，