銀杏內(nèi)生細(xì)菌防治辣椒疫病機(jī)制研究.pdf

1、本研究從山東、河南、浙江及福建四個(gè)地區(qū)采集不同生長(zhǎng)年齡的健康銀杏葉片進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離，共獲得120株內(nèi)生細(xì)菌，來(lái)自山東泰安約50年生銀杏植株獲得21株，來(lái)自河南鄭州約30年生獲得62株，來(lái)自福建福州約10年生獲得17株，來(lái)自浙江杭州約100年生獲得20株。分離結(jié)果表明銀杏葉片內(nèi)存在大量的內(nèi)生細(xì)菌，且不同樹齡銀杏葉片內(nèi)生細(xì)菌的種群密度和含量存在顯著差異，表現(xiàn)為約50年生＞約30年生＞約10年生＞約100年生。利用16S rDNA PCR

2、-RFLP、ERIC-PCR和DNA gyrase B subunit（gyrB）基因測(cè)序的方法分析銀杏內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性，結(jié)果表明銀杏葉片內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的種群多樣性。16S rDNA PCR-RFLP分析結(jié)果表明120株內(nèi)生細(xì)菌菌株共產(chǎn)生42種酶切圖譜類型，具有優(yōu)勢(shì)RFLP圖譜類型的64個(gè)菌株有53個(gè)ERIC-PCR圖譜類型，表明銀杏優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌具有相對(duì)豐富的遺傳型。將每一個(gè)RFLP圖譜類型中的代表菌株進(jìn)行g(shù)yrB基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)

3、果表明代表菌株共屬于9個(gè)屬26個(gè)種，其中芽胞桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌為銀杏葉片中內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群。
　　通過平板對(duì)峙試驗(yàn)從來(lái)自銀杏葉片的120株內(nèi)生細(xì)菌中篩選獲得35株對(duì)辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）具有拮抗作用的菌株，其中8個(gè)菌株Zy44、Fy11、Hy7、Hy14、Zy25、Zy45、Zy55和Sy15對(duì)辣椒疫霉菌拮抗活性較強(qiáng)，抑菌帶的寬度均在10mm以上。

4、進(jìn)一步測(cè)定8個(gè)內(nèi)生細(xì)菌菌株對(duì)其他一些供試植物病原菌的平板拮抗作用，結(jié)果表明這8個(gè)菌株對(duì)測(cè)試的病原菌均有不同程度的抑制作用。繼續(xù)測(cè)定8個(gè)拮抗菌株對(duì)辣椒果疫病的防治效果，發(fā)現(xiàn)8個(gè)測(cè)試菌株對(duì)辣椒果疫病均有不同程度的防病作用，其中5個(gè)菌株Zy44、Fy11、Hy7、Hy14和Zy25防效顯著，挑戰(zhàn)接種病原菌6d后，防效仍保持在70%以上。溫室盆栽辣椒苗疫病的防治試驗(yàn)表明，菌株Zy44和Fy11對(duì)辣椒苗疫病具有較好的防治效果，接種病原菌20d后，

5、兩個(gè)菌株的防效保持在50%以上。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特征測(cè)試、16S rDNA序列和gyrB基因序列分析，鑒定4個(gè)生防菌株 Zy44、Fy11、Hy7和 Zy25為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
　　三個(gè)生防菌株Fy11、Hy7和Zy44混配后對(duì)辣椒果疫病和苗疫病的防治試驗(yàn)表明，F(xiàn)y11和Zy44混配后能夠顯著增加辣椒果疫病和苗疫病的防治效果，接種病原菌7d后，對(duì)辣椒果疫病的防病效果仍保持

6、在76.30%，接種病原菌20d后，對(duì)辣椒苗疫病的防病效果為71.30%。溫室盆栽辣椒苗的促生試驗(yàn)表明，3個(gè)生防菌株均能顯著促進(jìn)辣椒幼苗的生長(zhǎng)，菌株Fy11、Hy7和Zy44對(duì)辣椒苗的促生增長(zhǎng)率分別為43.65%、39.53%、46.93%。應(yīng)用綠色熒光蛋白 GFP基因標(biāo)記生防菌株，工程菌株Fy11-gfp和Zy44-gfp在辣椒組織內(nèi)的定殖研究表明，兩個(gè)生防菌株均可在辣椒組織內(nèi)定殖，能夠從根部運(yùn)輸?shù)角o和葉。在整個(gè)分離過程中，菌株 Fy

7、11的定殖量顯著高于菌株Zy44，尤其是辣椒的莖和葉組織中。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Fy11和Zy44混合后接種辣椒幼苗后，其定殖數(shù)量與單個(gè)生防菌株的定殖數(shù)量并沒有顯著差異。進(jìn)一步對(duì)菌株Fy11和Zy44胞外代謝物質(zhì)的防病效果進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Zy44的發(fā)酵濾液和脂肽類粗提物對(duì)辣椒苗疫病的防治效果顯著高于菌株 Fy11的發(fā)酵濾液和脂肽類粗提物，同時(shí) Zy44脂肽類粗提物對(duì)辣椒苗疫病的防治效果高于該菌株的發(fā)酵濾液。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Zy44的脂

8、肽類粗提物能夠?qū)е吕苯芬呙咕z畸形，并抑制其游動(dòng)孢子囊的形成。在研究生防菌株Fy11和Zy44誘導(dǎo)辣椒系統(tǒng)抗性時(shí)，熒光定量PCR的結(jié)果表明內(nèi)生細(xì)菌澆灌處理，再挑戰(zhàn)接種病原菌后，菌株Fy11能夠誘導(dǎo)辣椒防病相關(guān)基因的表達(dá)，顯著增強(qiáng)防病基因CaPR4（辣椒病程相關(guān)蛋白4）的表達(dá)，Zy44處理、SA處理以及病原菌處理后辣椒幼苗防病相關(guān)基因的表達(dá)量基本相同。
　　利用合成擴(kuò)增枯草芽胞桿菌功能基因bmyB、fenD、ituC、srfAA、

9、srfAB和bioA、yngG和yndJ的8對(duì)特異引物PCR擴(kuò)增拮抗芽胞桿菌Zy25和Hy7的生防功能基因，發(fā)現(xiàn)均可以擴(kuò)增獲得8個(gè)生防基因片段，表明菌株Zy25和Hy7可能具有合成脂肽類物質(zhì)的能力。平板拮抗作用測(cè)試表明其合成的脂肽類物質(zhì)可抑制多種植物病原真菌的生長(zhǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)拮抗芽胞桿菌的脂肽類粗提物能夠?qū)е轮参锊≡婢z畸形，原生質(zhì)凝結(jié)，無(wú)法擴(kuò)展生長(zhǎng)?；铙w生防試驗(yàn)表明Zy25和Hy7脂肽類粗提物能夠有效的防治辣椒果疫病和番

10、茄果實(shí)灰霉病。
　　利用cDNA-AFLP技術(shù)，采用256對(duì)引物，分析辣椒幼苗接種內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌Fy11后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)譜，初步明確內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌Fy11誘導(dǎo)辣椒幼苗差異表達(dá)基因。結(jié)果表明256對(duì)引物共產(chǎn)生18620個(gè)轉(zhuǎn)錄本（TDFs），篩選得到353條差異表達(dá)條帶，占擴(kuò)增條帶總數(shù)的1.89%。經(jīng)克隆、測(cè)序分析，最終獲得257個(gè)差異TDFs，聚類分析得到229個(gè)ESTs（unigenes），其中144個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，

11、85個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。經(jīng)Blastx比對(duì)和功能分類分析，其中65條ESTs（28.38%）未找到同源性匹配，8條（3.49%）與未知功能蛋白同源性較高。其余156條ESTs主要涉及基礎(chǔ)代謝基因（10.92%）；與能量和抗病與防御類相關(guān)基因，各占8.73%；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因占7.42%；轉(zhuǎn)運(yùn)子或轉(zhuǎn)座子基因占6.99%；與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因占6.55%；參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因占5.68%；細(xì)胞生長(zhǎng)類基因占3.93%；參與蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存8個(gè)基因，占3.4