家禽Toll樣受體基因的克隆、序列分析及不同品種雞抗沙門菌感染天然免疫應(yīng)答研究.pdf

1、Toll樣受體（TLRs）是模式識別受體(PRRs)中的一個家族，屬于Ⅰ型跨膜受體，宿主通過模式識別受體識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）。這種識別可激活隨后的信號通路，從而引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答。TLR5在宿主防御細菌病原中發(fā)揮重要作用，可識別細菌的鞭毛蛋白;TLR15是禽類特有的，在哺乳動物中無同源相似物，可識別沙門菌的某些成分。家禽制品的沙門菌污染是一種全球性的公共衛(wèi)生威脅。近年來在我國，腸炎沙門菌(SE)被認(rèn)為是引起食物中毒最主要的

2、因素之一。深入理解宿主抗SE的天然免疫應(yīng)答將會為降低家禽制品的病原污染提供更多的選擇。我國雞遺傳資源非常豐富，擁有80多種不同品種雞。這些資源可為我國乃至世界范圍的養(yǎng)禽業(yè)提供有價值的育種材料。然而，迄今尚未有關(guān)于我國品種雞抗SE的天然免疫應(yīng)答方面的相關(guān)研究報道。本研究旨在克隆和比較我國不同品種雞的TLR5和TLR15基因序列，并從天然免疫角度探討不同的遺傳品種雞抗SE感染能力的差異，從而為進一步研究雞TLRs功能以及家禽在抗沙門菌感染研

3、究方面積累一些理論依據(jù)。
　　 1.我國不同地方品種雞TLR5、TLR15和鵝TLR5基因的克隆及其序列分析
　　 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的雞TLR5和TLR15基因序列，設(shè)計特異性引物，以雞基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因，并對測序結(jié)果進行比較分析。另外，利用RapidamplificationofcDNAends(RACE)技術(shù)克隆出鵝TLR5基因，并將其與其它物種的TLR5基因序列進行同源比較。應(yīng)用SMA

4、RT程序?qū)﹄uTLR5、TLR15和鵝TLR5基因蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，結(jié)果顯示它們都屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，具有典型的TLR結(jié)構(gòu)特征，即由胞外富含亮氨酸重復(fù)區(qū)（leucine-richrepeats，LRRs）、跨膜區(qū)和胞內(nèi)Toll/interleukin-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域組成。鵝TLR5基因的開放閱讀框(ORF)為2583bp，編碼860個氨基酸，為單一外顯子;其氨基酸序列與人、小鼠和雞的TLR5氨基酸序列同源性分別為50.3％、49

5、.9％和82.7％-82.8％。TLR5和TLR15基因在不同品種雞之間存在較高的同源性，相對保守;不同品種雞的TLR5基因核苷酸同源性在99.8％以上，氨基酸同源性在99.4％-99.9％之間;TLR15基因的核苷酸同源性在99.7％以上，氨基酸同源性在99.4％-99.9％之間。不同品種雞的TLR5基因ORF內(nèi)有9個不同的核苷酸位點，其中有4個屬于非同義替換，主要分布在烏骨雞和青殼雞中;這4個位點都位于胞外區(qū)，其中1個位于LRR中(

6、E341K)，1個位于LRRCT中(A619E)。不同品種雞的TLR15基因ORF內(nèi)有16個不同的核苷酸位點，其中有7個屬于非同義替換;這7個位點中有4個位于胞外區(qū)(E158K、A309E、L332F和K389R)，但都不在LRR中;另外3個位點位于胞內(nèi)區(qū)，其中1個位于TIR中(F710L)，主要分布在安卡雞中。這些變化位點可能會影響TLRs對相應(yīng)配體的識別作用，從而影響機體對入侵病原的免疫應(yīng)答。
　　 2.不同地方品種雞抗腸炎

7、沙門菌感染天然免疫應(yīng)答研究
　　 采集我國4個不同地方品種雞（青腳麻雞、三黃雞、烏骨雞和雪山麻雞）的全血，分離外周血淋巴細胞(PBMCs)，體外感染腸炎沙門菌50041株，分別在感染后2和4h，應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測相關(guān)TLRs（TLR4、TLR5和TLR15）和細胞因子（IL-1β、IL-6、TGF-β4、CXCLi2和CCLi2）mRNA的表達情況。結(jié)果顯示，感染后烏骨雞和雪山麻雞的TLR4和TLR15mRNA表達量高于

8、另外兩個品種雞，而TLR5在三黃雞中表達量低于其它3個品種雞;烏骨雞和雪山麻雞中IL-1β、IL-6、CXCLi2和CCLi2mRNA的表達量要高于青腳麻雞和三黃雞;感染后4h時，青腳麻雞中TGF-β4mRNA的表達量要顯著高于雪山麻雞(p＜0.05)。
　　 通過上述的體外感染實驗結(jié)果，可以初步看出烏骨雞和雪山麻雞對腸炎沙門菌具有較高的抵抗力。鑒于此，本文接著研究了其中3個品種雞（三黃雞、烏骨雞和雪山麻雞）口服感染SE后，脾臟

9、和盲腸扁桃體中相關(guān)TLRs和細胞因子mRNA的表達情況。SE口服感染后，三種TLRs（TLR4、TLR5和TLR15）在雪山麻雞的脾臟和烏骨雞的盲腸扁桃體中的表達量相對于其它品種雞而言要高。烏骨雞和/或雪山麻雞的脾臟和盲腸扁桃體中IL-1β、IL-6和CCLi2mRNA在感染后呈較高水平地表達，且三黃雞盲腸扁桃體中這些細胞因子的表達要低于未感染的雞;此外，SE感染也引起雪山麻雞脾臟和烏骨雞盲腸扁桃體中的CXCLi2mRNA高量表達，表明