基于甘藍(lán)型油菜恢復(fù)基因BnMs1創(chuàng)建全不育群體初探.pdf

1、油菜是我國(guó)最重要的油料作物之一，目前主要利用雜種優(yōu)勢(shì)來提高油菜產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性，而油菜隱性細(xì)胞核雄性不育是油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑。甘藍(lán)型油菜隱性核不育系S45AB的不育性受兩對(duì)隱性基因控制，利用其雜交制種時(shí)，母本行中50%的可育株需人工拔除，限制了它的廣泛應(yīng)用。因此，對(duì)該不育系利用的主要問題是如何低成本去除母本行中50%的可育植株。所以，本實(shí)驗(yàn)的主要目的是獲得100%全不育群體。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.AtLEC1(A

2、rabidopsis thaliana Leafy Cotyledonl)的克隆及誘導(dǎo)型無選擇標(biāo)記載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
　　 根據(jù)擬南芥基因組的序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，克隆了AtLEC1。與公布的序列相比(TAIR，The Arabidopsis Information Resource)，克隆的LEC1基因序列雖在669bp處堿基A/T被G/C替換，但其轉(zhuǎn)錄翻譯的氨基酸序列是相同的，因此克隆的AtLEC1可用于后續(xù)研究。參考Venka

3、ta et al.(2006)改進(jìn)的蛻皮素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，將AtLEC1與該系統(tǒng)的主要誘導(dǎo)元件以及恢復(fù)基因BnCYP704B1三者相連后分別導(dǎo)入到原始的和去除標(biāo)記基因的載體pCAMBIA2300中，將構(gòu)建的載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥和油菜。
　　 在擬南芥轉(zhuǎn)化中獲得了17株抗性苗，經(jīng)特異性引物檢測(cè)，T0代中有9株陽(yáng)性苗，其轉(zhuǎn)化率為54.1%。在油菜轉(zhuǎn)化中通過特異性的引物篩選出6株含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植株，且這些轉(zhuǎn)基因植株都含有標(biāo)

4、記基因。
　　 2.AtLEC1在擬南芥和油菜中的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 將獲得的9株T0代擬南芥陽(yáng)性植株收獲后播種得到T1代，各株系分別噴施四個(gè)濃度梯度(0nM，1000nM，5000nM，10000nM)的誘導(dǎo)劑甲氧蟲酰肼(methoxyfenozide)，并觀察植株的生長(zhǎng)狀況，大部分植株生長(zhǎng)正常，沒有出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)，但其中一個(gè)株系的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)在1000nM，5000nM和10000nM三個(gè)濃度梯度下相對(duì)野生型有差異。
　

5、　 在油菜轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中主要采用了兩種方法：(1)紙床發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，將T0代種子分別播于四個(gè)濃度梯度(同上)的誘導(dǎo)劑浸濕的紙床上，觀察其發(fā)芽和生長(zhǎng)情況，6個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因植株均能正常發(fā)芽，子葉正常，沒有發(fā)現(xiàn)壞死斑點(diǎn)；(2)田間誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，將收獲的6株T0代種子進(jìn)行田間播種，苗期時(shí)每三天噴施一次誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑濃度梯度同上。半個(gè)月后觀察植株的生長(zhǎng)狀況，6個(gè)株系均能正常生長(zhǎng)發(fā)育，沒有出現(xiàn)致死植株，在葉片上也沒有發(fā)現(xiàn)壞死斑點(diǎn)。植物后期發(fā)育良好，