豬徒手克隆技術(shù)的優(yōu)化及Tet1在早期胚胎發(fā)育中的變化.pdf

1、隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，體細胞克隆作為一種技術(shù)手段已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物、物種保護、家畜繁育、異種器官移植以及疾病模型的研究，但是克隆效率低下一直阻礙這一技術(shù)發(fā)展。一般認為克隆效率低下與重構(gòu)胚不正確或者不完全的重組而導(dǎo)致的錯誤表觀修飾相關(guān)，其中最主要的就是DNA甲基化異常和組蛋白修飾錯誤。因此如何提高克隆效率對推動這一技術(shù)發(fā)展有著重要的意義。
　　1.徒手克隆技術(shù)的優(yōu)化
　　為提高徒手克隆效率，我們在徒手克隆過程中對克隆

2、胚重構(gòu)以及胚胎移植都進行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的囊胚率能達到40％左右，并將235枚桑椹胚及囊胚移植到3頭自然發(fā)情后4到5天的受體母豬子宮角內(nèi)，并使兩頭受體母豬成功懷孕，雖然1頭母豬中途不幸流產(chǎn)，但另1頭母豬在妊娠后第114天自然分娩產(chǎn)下8只小豬，相對與其他實驗室的克隆產(chǎn)子率明顯提高。
　　2.卵母細胞成熟過程及孤雌激活后胚胎發(fā)育中Tet1的免疫熒光染色
　　實驗選取成熟0h(GV)、12h、24h、36h和MⅡ時期脫完卵丘

3、的卵母細胞以及孤雌激活（物理+化學(xué)）后7.5h.12h、15h、24h和2-cell(36h)胚胎用PFA固定后進行免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在卵母細胞成熟過程中及PA后胚胎早期發(fā)育過程中，Tet1在不同階段出現(xiàn)不同的表達。結(jié)果表明Tet1可能在卵母細胞成熟過程及孤雌激活后胚胎發(fā)育中起著調(diào)控作用，但有待進一步研究。
　　3.5-aza-CdR對卵母細胞成熟過程中和胎兒成纖維細胞甲基化相關(guān)基因表達的影響
　　實驗對成熟培養(yǎng)的卵母細