有機(jī)磷類農(nóng)藥中毒的快速檢測與診斷技術(shù)研究.pdf

1、本文通過對一系列抗磷化絲氨酸(anti-phosphorserine，anti-Pser)和丁酰膽堿酯酶(anti-Butyrylcholinesterase，anti-BChE)抗體的篩選，獲得了一對能夠同時(shí)分別與OP-BChE結(jié)構(gòu)中的磷化（OP結(jié)構(gòu)）部分和蛋白（BChE結(jié)構(gòu)）部分結(jié)合的抗體，并建立了一套能夠快速檢測動(dòng)物血液中OP-BChE（一種有機(jī)磷神經(jīng)毒劑中毒的檢測靶標(biāo)）的夾心ELISA體系。其中，anti-BChE作為捕捉抗體(

2、capture antibody)，能夠公平識(shí)別磷化BChE（OP-BChE，以paraoxon-BChE為代表）和非磷化BChE，這樣它能夠?qū)悠分械腂ChE/OP-BChE準(zhǔn)確而快速地捕捉出來;另外，anti-Pser作為識(shí)別抗體(detection antibody)能夠檢測到OP-BChE中的OP結(jié)構(gòu)。在組成的夾心ELISA體系中，對一系列因素包括anti-BChE、anti-Pser的濃度和封閉液種類進(jìn)行優(yōu)化;優(yōu)化后，我們得到

3、一個(gè)線性范圍在0.03-30 nM，檢測限處于0.03 nM的檢測OP-BChE的夾心ELISA系統(tǒng)。同時(shí)，我們將該體系成功應(yīng)用于動(dòng)物血樣的體外檢測實(shí)驗(yàn):在大鼠血清中的添加回收率達(dá)到99％以上。故此，該方法的建立為能夠?qū)崿F(xiàn)快速，簡便，經(jīng)濟(jì)的現(xiàn)場檢測OP-BChE提供了一定的技術(shù)平臺(tái)。
　　 在已建立的檢測OP-BChE的sELISA體系的基礎(chǔ)上，我們建立了一種新型的能夠高精確度地檢測磷化丁酰膽堿酯酶(OP-BChE)的免疫電化學(xué)

4、傳感器。在該方法中，納米材料氧化鋯(ZrO2)是一種對“磷氧分子”（OP-）結(jié)構(gòu)有較高特異性識(shí)別的物質(zhì)，我們將它應(yīng)用于捕捉OP-BChE結(jié)構(gòu)中OP-部分，以達(dá)到捕獲樣品中OP-BChE的目的;并且利用已連有量子點(diǎn)(Quantum dot，QD)標(biāo)記物的anti-BChE(anti-BChE-QD)來特異性識(shí)別被捕獲的OP-BChE中的膽堿酯酶(BChE)部分。其中，QD標(biāo)記物由靈敏度較高的電化學(xué)方法測定。本節(jié)選定神經(jīng)毒劑二異丙基氟磷酸(

5、Diisopropylfluorophosphate，DFP)為代表，與不同樣品中的BChE結(jié)合形成OP-BChE。所建立的傳感器的線性范圍為0.1-30 nM，并且檢測限達(dá)到0.03 nM(以信噪比為3)，同時(shí)該方法具有較好重復(fù)性（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5％）。在此基礎(chǔ)上，該傳感器成功地運(yùn)用于實(shí)際樣品（人血清）中添加的OP-BChE的檢出。
　　 本文同時(shí)成功研制了一種能夠簡便、快速、靈敏地檢測由有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱中毒后在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)

6、生的代謝產(chǎn)物----Trichloropyridinol(TCP)的免疫層析電化學(xué)生物傳感器（Immunochromatographic Electrochemical Biosensor，IEB）。該方法利用IEB將免疫層析試紙條上的競爭性免疫反應(yīng)和平面印刷碳電極(Screen-Printed Carbon Electrode)中的電化學(xué)反應(yīng)相結(jié)合，將免疫層析試紙條上測試區(qū)域中捕獲的酶標(biāo)記物(HRP)轉(zhuǎn)換為電化學(xué)信號，以達(dá)到快速、靈敏

7、檢測的目的。在實(shí)驗(yàn)過程中，為了獲得更為靈敏的檢測體系，我們有針對性的地將一系列實(shí)驗(yàn)條件包括免疫反應(yīng)時(shí)間、封閉液種類、酶標(biāo)HTCP的數(shù)量以及酶催化底物的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，該IEB體系的線性范圍為0.1-100ng/ml，檢測限為0.1 ng/ml。同時(shí)，該IEB成功地應(yīng)用于大鼠的活體實(shí)驗(yàn):所建立的檢測體系成功地檢測出受Chlorpyrifos-oxon(CPF-oxon)污染的大鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物TCP。該方法為能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)

8、場快速診斷有機(jī)磷農(nóng)藥中毒提供了一條新的思路。
　　 本文還報(bào)道了一種基于磁珠(Magnetic Beads，MB)平臺(tái)下的免疫電化學(xué)傳感器，用以定量檢測受有機(jī)磷神經(jīng)毒劑污染的樣品中BChE的受抑制程度。該實(shí)驗(yàn)將anti-BChE和BChE分別與MB結(jié)合，并分別利用Ellman assay和competitive immunoassay同時(shí)測出樣品中仍保留活性的BChE的濃度和BChE（包括失活部分）的總量，并將兩者相減而獲得樣品

9、中BChE的抑制量，從而達(dá)到診斷在受到有機(jī)磷神經(jīng)毒劑侵染后動(dòng)物體中毒情況的目的。其中，在競爭性免疫檢測中，樣品中的待測BChE與固定在MB上已知濃度的BChE同時(shí)競爭量子點(diǎn)(Quantum Dot，QD)標(biāo)記的anti-BChE(QD-anti-BChE)上的活性位點(diǎn)。之后通過測定QD的電化學(xué)信號以確定樣品中目標(biāo)BChE的濃度。該方法能夠測定的BChE的濃度范圍為0.1-20 nM。與此同時(shí)，我們利用聯(lián)有微流控注射器的碳納米管電極(Sc

10、reen Printed Carbon nanotube Electrode)來測定被MB-anti-BChE捕獲的樣品中的BChE的活性來確定樣品中仍有活性的BChE的濃度。由此，樣品中BChE的受抑制程度便可以通過以上兩個(gè)測定結(jié)果的差異來確定。該種檢測方法表現(xiàn)出的靈敏度達(dá)到0.5 nM，低于體內(nèi)BChE總量（約50-80 nM）的2％。
　　 利用實(shí)驗(yàn)室已合成出的有機(jī)磷農(nóng)藥倍硫磷的5種半抗原(H1-H5)，制備出能穩(wěn)定分泌針

11、對有機(jī)磷農(nóng)藥倍硫磷的高特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;并建立了一套特異性強(qiáng)、靈敏度高的倍硫磷殘留免疫檢測方法。其中，利用活潑酯法將能夠最大程度地暴露芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的H3（6-{甲氧基[4-（甲硫基）苯氧基]硫代磷酰胺基}己酸）與Bovine Serum Albumin(BSA)偶聯(lián)，作為免疫原;將H1（4-[2-（二甲氧基硫代磷酰氧基）-4-甲基-5（甲硫基）苯胺基-4-羰基丁酸、H2（4-[4-（二甲氧基硫代磷酰氧基）-2-甲基苯基胺基

12、]-4-羰基丁酸）、H3、 H4（4-（二甲氧基硫代磷酰胺基）丁酸）以及H5（4-[3-甲級-4-(甲硫基)苯氧基]丁酸）與Ovalbumin(OVA)偶聯(lián)，作為候選包被原。將獲得的單克隆抗體分別與5種包被原組合，進(jìn)行間接競爭ELISA分析，篩選到具備最高特異性與靈敏度的組合。分析結(jié)果顯示，以H3-BSA為免疫原，以H5-OVA為包被原所組成的間接競爭ELISA體系能夠獲得較高的靈敏度和特異性。在對ELISA體系優(yōu)化之后，抗體與農(nóng)藥對硫