切花菊轉(zhuǎn)CcSOS1與CcSOS1-CdICE1雙價(jià)基因研究.pdf

1、菊花[Chrysanthemummorifolium(Ramat.)Kitamura]是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，栽培地域非常廣泛，在園林及家庭美化中占有十分重要的地位。高鹽、低溫、干旱是切花菊栽培中的主要脅迫因子，抗性切花菊的培育成為當(dāng)今花卉育種的重要課題之一。本研究將從大島野路菊中克隆得到的耐鹽基因CcSOS1的植物表達(dá)載體、從異色菊中克隆得到的轉(zhuǎn)錄因子CdICE1和大島野路菊CcSOS1構(gòu)建的雙價(jià)表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌EHA

2、105介導(dǎo)的葉圓片法轉(zhuǎn)入到切花菊‘神馬’中。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行了抗性（高鹽、低溫、干旱）鑒定，測(cè)定了逆境脅迫下基因表達(dá)量變化及相關(guān)生理指標(biāo)。研究結(jié)果如下:
　　 1.CcSOS1基因轉(zhuǎn)基因切花菊的獲得
　　 成功構(gòu)建了CcSOS1基因正義表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化切花菊‘神馬’。經(jīng)過(guò)潮霉素的抗性篩選、潮霉素抗性植株P(guān)CR、熒光定量RT-PCR檢測(cè)，證實(shí)了目的基因已經(jīng)整合到受體植株的基因組中，并超表達(dá)。經(jīng)過(guò)分子鑒定

3、共獲得9個(gè)轉(zhuǎn)CcSOS1基因株系，其中S11、S12兩個(gè)株系中SOS1基因的表達(dá)量最高。
　　 2.轉(zhuǎn)CcSOS1基因植株抗鹽性鑒定
　　 對(duì)轉(zhuǎn)基因株系S11、S12及未轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行耐鹽性分析，結(jié)果表明，S11、S12轉(zhuǎn)基因株系的存活率分別(88.9％、83.3％)，顯著高于對(duì)照的存活率(55.6％)，表明CcSOS1轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性較對(duì)照明顯提高。在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的單株受害面積比率、相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于對(duì)照，而葉

4、綠素含量、脯氨酸含量及SOD、POD活性都顯著高于對(duì)照植株，表明植株在受到鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因植株抗?jié)B透脅迫和抗氧化能力均得到了提高，從而提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。鹽脅迫后對(duì)植株不同部位Na+、K+含量分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株S11、S12的根、莖、中位葉、上位葉中Na+都顯著低于對(duì)照，且Na+分布以中位葉中最多，其次是上位葉、莖、根。而K+含量正好跟Na+含量相反，S11、S12株系中K+含量明顯高于對(duì)照，且在根中分布最多，其次是莖、中位

5、葉、上位葉。離子的含量變化表明，在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系起到了保鉀排鈉的作用，減少了過(guò)多鈉離子的積累，從而減輕對(duì)植物體傷害。
　　 3.CcSOS1-CdICE1雙價(jià)基因轉(zhuǎn)基因株系獲得及抗性鑒定
　　 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行了CcSOS1-CdICE1雙價(jià)基因?qū)η谢ň铡耨R’的遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)PCR、qRT-PCR分子鑒定共獲得8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，其中SI6、SI9兩個(gè)株系中CcSOS1、CdICE1基因的表達(dá)量均高于對(duì)照

6、。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了抗性（低溫、干旱、高鹽）分析，探討了與抗性相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)變化及生理指標(biāo)變化。結(jié)果表明，SI6、SI9轉(zhuǎn)基因株系的半致死溫度(-8.61℃、-9.33℃)顯著低于對(duì)照植株(-5.48℃)。低溫處理下植株存活率分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)4℃馴化的SI6、SI9轉(zhuǎn)基因株系-6℃處理后的存活率(79.2％、83.3％)顯著高于對(duì)照(66.7％)，-9℃處理后的存活率(66.7％、62.5％)也顯著高于對(duì)照(33.3％

7、);未經(jīng)過(guò)4℃馴化直接進(jìn)行低溫處理的轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株的存活率沒(méi)有明顯差別。4℃處理后，不同時(shí)間點(diǎn)CdICE1基因的表達(dá)量都出現(xiàn)了先升高后降低的變化，且SI6、SI9基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照。結(jié)果說(shuō)明了CdICE1基因在冷誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，從而激活下游耐寒相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照植株進(jìn)行干旱脅迫處理，結(jié)果表明，SI6、SI9轉(zhuǎn)基因株系的存活率(77.8％、72.2％)明顯高于對(duì)照(44.4％)，表明了轉(zhuǎn)基因株系的

8、耐旱能力提高。CdICE1轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)激活下游一些耐旱基因的表達(dá)，從而提高了植株的耐旱能力。
　　 對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株進(jìn)行鹽脅迫處理，結(jié)果顯示，SI6、SI9轉(zhuǎn)基因株系鹽脅迫后恢復(fù)生長(zhǎng)存活率(88.9％、94.4％)明顯高于對(duì)照(55.6％)。SI6、SI9轉(zhuǎn)基因株系的單株受害葉面積比率和相對(duì)電導(dǎo)率明顯低于對(duì)照，葉綠素含量、脯氨酸含量、SOD和POD活性明顯高于對(duì)照，Na+和K+含量變化同轉(zhuǎn)CcSOS1基因離子檢測(cè)結(jié)果基