云斑天牛觸角cDNA文庫的構(gòu)建及相關(guān)嗅覺蛋白的表達(dá)及功能分析.pdf

1、自然界中，昆蟲對化學(xué)信號物質(zhì)的感知主要通過兩種化學(xué)感受機(jī)制：嗅覺和味覺。借助特定的化學(xué)感覺機(jī)制，昆蟲的嗅覺系統(tǒng)能夠感知其周圍環(huán)境中的大量紛繁復(fù)雜的化學(xué)信息，完成寄主定位、尋找食物配偶、躲避天敵的捕捉、避免有毒物質(zhì)以及尋找繁殖場所等多種生理行為。闡明昆蟲的化學(xué)感受機(jī)理，可以加深對昆蟲與植物、昆蟲與昆蟲之間相互關(guān)系的了解，幫助我們設(shè)計(jì)新的方法來進(jìn)行害蟲治理。云斑天牛Batocera horsfieldi(Hope)屬于鞘翅目天?？疲且环N重

2、要的蛀干害蟲，主要以幼蟲蛀食樹干和成蟲補(bǔ)充營方式養(yǎng)危害樹木。由于云斑天牛蛀害，導(dǎo)致楊樹樹勢衰弱或全株枯死；同時(shí)還造成了楊樹材質(zhì)的損害，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，對云斑天牛的行為學(xué)研究比較多，但對云斑天牛嗅覺識(shí)別機(jī)制的分子機(jī)制研究，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。為此我們通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建cDNA文庫并結(jié)合批量ESTs測序，對云斑天牛觸角功能基因進(jìn)行了分析。通過對主要的觸角氣味結(jié)合蛋白OBPs和化學(xué)感受蛋白CSPs進(jìn)行基因克隆，分析其在不同組織中

3、的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜特征，以及對OBP2和CSP2蛋白的表達(dá)純化，初步探討了其生理功能。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、云斑天牛成蟲觸角cDNA文庫的構(gòu)建
　　 通過LD-PCR技術(shù)合成全長ds-cDNA，電泳后，對0.3-0.6kb ds-cDNA和0.6-1kbds-cDNA分別割膠回收，連接到pDNR-LIB載體上。對擴(kuò)增文庫分別采用PCR擴(kuò)增和藍(lán)白斑篩選的方法進(jìn)行鑒定，本研究構(gòu)建的云斑天牛0.3-0.6kb cDNA文庫滴

4、度為6.4×105 cfu/rriL，庫容量為8.9×105克隆，得重組率94.5%；0.6-1kb cDNA文庫滴度為4.1×106 cfu/mL，庫容量為5.8×106克隆，得重組率93.2%，且序列基本上均為全長，這充分說明兩個(gè)定向片段大小的文庫構(gòu)建得較好。通過測序，成功得到了有效ESTs序列692條，經(jīng)拼接后分別得到“Contigs”和“Singlets”序列分別為79個(gè)和323個(gè)，其中功能基因246個(gè)，同源但無注釋功能等的基因

5、34個(gè)。從拼接后的BLASTx結(jié)果看，包括68條云斑天牛氣味結(jié)合蛋白及化學(xué)感受相關(guān)的基因，去除重復(fù)的序列，得到了4個(gè)Odorant Binding proteins(OBPs)基因，3個(gè)Chemosensory Proteins(CSPs)基因，2個(gè)Pheromone binding proteins(PBP)基因以及9個(gè)Minus-OBP基因，為廣泛開展云斑天牛分子生物學(xué)研究提供了重要的參考和依據(jù)。
　　 2、云斑天牛氣味結(jié)合

6、蛋白和化學(xué)感受蛋白的克隆及序列分析
　　 利用RT-PCR技術(shù)克隆得到云斑天牛3個(gè)普通氣味結(jié)合蛋白(GOBP)基因BhorGOBP1、BhorGOBP2及BhorGOBP3，分別編碼142、137和125個(gè)氨基酸，預(yù)測N-末端分別包含20，19和20個(gè)氨基酸組成的信號肽序列。這三個(gè)基因編碼的氨基酸序列和鞘翅目昆蟲GOBP的氨基酸序列比對同源性較高(50%左右)，但是BhorGOBP1、BhorGOBP2和BhorOBP3的同源性

7、只有12.68%，說明它們屬于不同的GOBP類群；同時(shí)克隆得到3個(gè)化學(xué)感受蛋白(CSP)基因BhorCSP1、BhorCSP2及BhorCSP3的ORF全長，分別編碼127、130和125個(gè)氨基酸，預(yù)測N-末端分別包含20、19和20個(gè)氨基酸組成的信號肽序列，所得到的3個(gè)CSP基因序列已提交到GenBank，其登錄號分別為HQ587041，HQ587040和HQ587042。從序列連配的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在CSPs中存在有3個(gè)高度保守的區(qū)域

8、結(jié)構(gòu)，分別是位于N-端的Motif A區(qū) YTTKYDN[V/I][N/D][L/V]DEIL，中心的Motif B區(qū) DGKELKXX[I/L]PDAL，和位于C-端的Motif C區(qū)KYDP，進(jìn)一步分析表明，位于第53、110、123位置的芬芳族殘基，以及位于第91/92位的(glutamine/lysine)和129/130位的(lysine/tyrosine)均高度保守。
　　 3、云斑天牛氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白的時(shí)

9、空表達(dá)譜研究
　　 依據(jù)已克隆得到的云斑天牛Batocera horsfieldi氣味結(jié)合蛋白OBPs和化學(xué)感受蛋白CSPs基因全長序列設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR和Real Time-PCR技術(shù)對云斑天牛主要OBPs基因和CSPs基因在云斑天牛成蟲的不同組織及羽化后各個(gè)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜進(jìn)行了研究。基于云斑天牛成蟲期RT-PCR的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)OBP基因和3個(gè)CSP基因在頭部(去除觸角)均不表達(dá)，而在觸角、下顎須、下

10、唇須、翅、足、腹部均有表達(dá)。Q-PCR結(jié)果顯示3個(gè)OBP基因在觸角中在不同發(fā)育階段的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于3個(gè)CSP基因；OBPs和CSPs在雄蟲不同組織其表達(dá)量要高于雌蟲(無論交配與否)；在羽化后1-5天以及羽化后30天左右OBPs和CSPs的表達(dá)量較高，遠(yuǎn)高于中間時(shí)期的表達(dá)量。結(jié)果表明BhorCSPs除了嗅覺功能外，可能還在云斑天牛感受外界化合物的過程中發(fā)揮著其它重要作用，其在雌雄蟲中不同的表達(dá)量及不同時(shí)期表達(dá)量的不同也表明OBPs和CSP

11、s在雄蟲尋找配偶及雌蟲尋找補(bǔ)充營養(yǎng)寄主及產(chǎn)卵場所的過程中發(fā)揮著重要的功能。
　　 4、云斑天牛氣味結(jié)合蛋白OBP2和化學(xué)感受蛋白CSP2的原核表達(dá)純化
　　 成功構(gòu)建了云斑天牛BhorOBP2和BhorCSPSP2的原核表達(dá)質(zhì)粒，由于目的蛋白含有二硫鍵，我們最終選擇以pET32a原核表達(dá)載體來表達(dá)目的蛋白，pET32a融合表達(dá)系統(tǒng)含有一個(gè)硫氧還蛋白標(biāo)簽(Trx)，該標(biāo)簽不僅可以增加蛋白的可溶性，而且能夠催化二硫鍵的正確形

12、成，因此非常適合含有二硫鍵的OBPs(3對)和CSPs(2對)蛋白的表達(dá)；同時(shí)，我們對pET32a進(jìn)行了人工改造，將pET32a載體自帶的Thrombin酶切位點(diǎn)的識(shí)別序列突變掉，然后在目的蛋白基因的起始密碼子前面加上一個(gè)Thrombin識(shí)別序列，同時(shí)為了將該序列和目的蛋白保持一定的空間距離，在二者之間還添加了一段Linker序列(GGGGSGGG)，最終使切除的標(biāo)簽從分子量和pI均和目的蛋白有一定的差別，利于后續(xù)的純化。通過對溫度以及