水稻OsHO2的基因克隆及轉(zhuǎn)SE5(OsHO1)擬南芥提高對(duì)除草劑paraquat耐性的初步研究.pdf

1、血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO，EC1.14.99.3)可催化血紅素降解生成膽綠素(BV)、一氧化碳(CO)和亞鐵離子(Fe2+)。近年的研究表明，除了在生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要作用，如參與光敏色素發(fā)色團(tuán)的合成、促進(jìn)側(cè)根和不定根的發(fā)生等，HO還廣泛參與植物對(duì)外界脅迫的響應(yīng)。水稻中的SE5（OsHO1）基因已有報(bào)道;但OsHO2基因尚未鑒定，OsHO1在植物抗逆中的功能也有待進(jìn)一步研究。
　　 本研究以水稻（Oryz

2、a sativa L.）為材料，克隆得到水稻OsHO2基因。該基因的cDNA序列由四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子組成，編碼了一個(gè)包含331個(gè)氨基酸殘基的多肽，其中含有47個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。蛋白序列分析表明，OsHO2含有血紅素加氧酶的保守特征序列，并與其他植物中的HO蛋白序列保持高度的一致性，但是其不具有結(jié)合血紅素(heme)的His位點(diǎn);通過(guò)構(gòu)建成熟HO蛋白基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功表達(dá)融合6×His的成熟HO2(His-mOsHO

3、2)蛋白，經(jīng)鎳柱親和純化，得到純度較高的融合蛋白;酶活性測(cè)定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不具有催化heme降解并產(chǎn)生BV的特征峰，表明OsHO2可能不是真正意義上的血紅素加氧酶;此外，通過(guò)構(gòu)建融合了OsHO2導(dǎo)肽基因序列的綠色熒光蛋白(GFP)基因載體，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片表皮的瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsHO2定位于質(zhì)膜上;半定量RT-PCR結(jié)果顯示，OsHO2在水稻幼苗葉片中表達(dá)量最高，莖中次之，根部和萌發(fā)的種子內(nèi)表達(dá)量最低。同時(shí)，OsHO2的表達(dá)會(huì)受到一

4、些脅迫的顯著誘導(dǎo)，如除草劑paraquat和NaCl等，表明OsHO2基因可能在應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)起一定的作用。
　　 同時(shí)，初步研究了水稻SE5(OsHO1)基因?qū)Τ輨﹑araquat引起的氧化傷害的防護(hù)作用。為了驗(yàn)證OsHO1基因的這一功能，首先構(gòu)建了OsHO1的擬南芥過(guò)表達(dá)植株（35S∶OsHO1）。研究發(fā)現(xiàn)，paraquat處理后，35S∶OsHO1在種子萌發(fā)率、幼苗鮮重以及葉綠素含量指標(biāo)上均高于野生型植株;用paraq

5、uat噴施擬南芥成苗，經(jīng)ROS染色分析發(fā)現(xiàn)，35S∶OsHO1體內(nèi)的ROS含量較野生型更低;同時(shí)，CAT、POD和SOD的酶活性測(cè)定及其轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，35S∶OsHO1體內(nèi)的抗氧化酶的酶活性以及基因表達(dá)水平均比野生型高。結(jié)合采用paraquat、hemin（HO-1誘導(dǎo)劑）、CO（HO-1產(chǎn)物）和ZnPP（HO-1抑制劑）對(duì)擬南芥幼苗處理顯示，hemin和CO能緩解paraquat造成的氧化傷害，而ZnPP會(huì)加重其造成的傷害。綜上結(jié)果