棉花分生組織轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究.pdf

1、近年來(lái)大多研究學(xué)者通過(guò)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良棉花性狀,已成功獲得了多種優(yōu)良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因棉花。大多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法及花粉管道法,其中關(guān)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化的研究頗多且研究機(jī)理較清楚。
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系通常以下胚軸為外植體,經(jīng)歷組織培養(yǎng)的過(guò)程獲得再生植株。但該遺傳轉(zhuǎn)化體系通常受到基因型限制、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)、成胚率低等因素的限制。棉花莖尖分生組織具有發(fā)育成完整植株的能力,不受品種的限制及實(shí)驗(yàn)周期短。本文在前人的工

2、作基礎(chǔ)上對(duì)棉花莖尖分生組織遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行改良。
　　目的:高速渦旋的玻璃粉創(chuàng)傷新陸早33成熟棉胚的莖尖分生組織,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將gusA報(bào)告基因?qū)朊藁?通過(guò)檢測(cè)評(píng)估該方法的轉(zhuǎn)化效率,探討不同的轉(zhuǎn)化條件(不同菌株、不同濃度、不同侵染方式、玻璃粉量及渦旋時(shí)間)對(duì)該方法遺傳轉(zhuǎn)化的影響。方法:棉花種子消毒后在無(wú)菌條件下用手剝離出棉胚,去除子葉后完全暴露出莖尖分生組織且不受損傷。2mLMS液體培養(yǎng)基、玻璃粉及棉胚轉(zhuǎn)至10mL離心管,3

3、000rpm高速渦旋創(chuàng)傷成熟棉胚后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染,設(shè)置了不同的單因素轉(zhuǎn)化條件:兩種菌種、三種菌液濃度、不同侵染方式、三種不同玻璃粉量及兩個(gè)渦旋時(shí)間。GUS組織化學(xué)染色部分棉胚及石蠟切片觀察棉胚轉(zhuǎn)化情況,余下棉胚篩選培養(yǎng)出幼苗,移栽后對(duì)幼苗葉片進(jìn)行卡那霉素初步篩選、PCR檢測(cè)及GUS組織化學(xué)染色。
　　結(jié)果:農(nóng)桿菌LBA4404與GV3101分別侵染棉胚,GUS染色發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化棉胚后較多細(xì)胞能被著色。GUS染色發(fā)

4、現(xiàn)菌液濃度OD600為0.8時(shí)棉胚的較多細(xì)胞被著色,能表達(dá)gusA的活性。采用不同的方法侵染棉胚,GUS染色發(fā)現(xiàn)方法1轉(zhuǎn)化棉胚后較多細(xì)胞能被著色。玻璃粉量越大對(duì)棉胚的損傷越嚴(yán)重,即插入棉胚的玻璃粉量越多,GUS染色發(fā)現(xiàn)0.2g玻璃粉轉(zhuǎn)化條件下棉胚及莖尖分生組織較多的細(xì)胞被染成藍(lán)色。隨著玻璃粉量加大,幼苗成活率降低,0.2g玻璃粉轉(zhuǎn)化條件下成活12株幼苗,比較適宜。渦旋時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)棉胚及莖尖分生組織損傷越嚴(yán)重,即插入棉胚的玻璃粉量越多,成苗

5、量下降,渦旋90s轉(zhuǎn)化條件下成苗量較低,但轉(zhuǎn)化效率有所提高,獲得2株GUS陽(yáng)性苗。將染色后的棉胚石蠟切片后發(fā)現(xiàn)莖尖分生組織被染色且多層細(xì)胞能被著色。移栽成活78株幼苗,成活率為72.2％,用高濃度(200g/L)卡那霉素篩選幼苗葉片,篩選效果不明顯。PCR檢測(cè)到3株幼苗能擴(kuò)出494bp條帶,GUS染色葉片后未被著色,為假陽(yáng)性。結(jié)論:農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化效果較好;菌液濃度OD600為0.8時(shí)轉(zhuǎn)化效果較好;方法1的侵染效果較好。不同玻璃