新生仔豬肝臟mRNA與miRNA表達譜的品種差異及糖皮質(zhì)激素的作用.pdf

1、不同品種的豬性狀差異顯著，為動物基因組的研究提供了很有價值的模型。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)二花臉豬(Erhualian，EHL)和大白豬(LargeWhite，LW)各種代謝指標差異顯著，推測可能與糖皮質(zhì)激素水平的差異有關。肝臟是機體最重要的代謝器官之一，肝細胞富含線粒體，而線粒體氧化磷酸化是生成ATP的重要途徑，因此肝臟決定了機體的能量穩(wěn)態(tài)和代謝類型。二花臉豬和大白豬具有截然不同的代謝類型，但對兩品種豬肝臟mRNA表達譜差異的研究卻所知甚少

2、。小RNA(microRNA，miRNA)是近年來研究的熱點，miRNA可以通過靶向3'非翻譯區(qū)(3'untranslatedregions，3'UTR)序列促進靶基因mRNA降解或抑制翻譯，從而調(diào)控功能基因的表達。肝臟代謝相關的功能基因也受miRNA的調(diào)控，但豬肝臟miRNA表達譜是否存在品種差異，是否與肝臟mRNA表達譜的品種差異相關聯(lián)，均未見報道。糖皮質(zhì)激素對肝臟代謝有重要作用，豬肝臟差異表達的mRNA和miRNA是否與糖皮質(zhì)激素

3、有關，糖皮質(zhì)激素是否影響豬肝臟miRNA生成通路，尚屬未知。研究表明，糖皮質(zhì)激素受體可轉(zhuǎn)位到線粒體中調(diào)節(jié)線粒體基因的轉(zhuǎn)錄，不同品種豬血清糖皮質(zhì)激素水平的差異是否會導致肝臟線粒體基因轉(zhuǎn)錄的差異，也仍屬未知。故而，本實驗的目的是將二花臉和大白豬肝臟中差異表達的miRNA和mRNA進行共分析，從而揭示其與代謝指標之間的關系;并探討豬肝臟線粒體基因轉(zhuǎn)錄和miRNA生成過程的品種差異是否與糖皮質(zhì)激素有關。
　　1新生仔豬肝臟miRNA和mR

4、NA表達譜共分析
　　miRNA參與肝臟的各種代謝過程，發(fā)揮調(diào)控作用，然而我們對品種特異性的miRNA表達及其與mRNA表達之間的關系知之甚少。我們選用具有明確代謝特征差異的兩個品種——大白和二花臉的新生雄性仔豬，使用芯片（microarray）進行了mRNA表達譜的研究，使用芯片和深度測序進行了miRNA表達譜的研究，并且將miRNA與mRNA表達進行了共分析，以揭示其與生理生化指標之間的關系。與大白豬相比，二花臉新生仔豬肝臟有

5、30個上調(diào)和18個下調(diào)miRNA，298個上調(diào)和510個下調(diào)的mRNA。對部分差異表達miRNA的RT-PCR檢測也確證了高通量分析的結果。使用靶點預測算法，我們發(fā)現(xiàn)在二花臉豬中上調(diào)的miRNA與下調(diào)的mRNA之間存在顯著的相關性。對蛋白水解過程中差異表達基因的預測發(fā)現(xiàn)，這個過程是被miRNA調(diào)控的。二花臉豬血清中大部分游離氨基酸的含量都顯著低于大白豬，這可能與二花臉豬肝臟蛋白水解能力較低有關。
　　以上結果為豬肝臟的miRNA和

6、mRNA表達譜研究提供了新的信息，為揭示豬品種間特異性性狀產(chǎn)生的分子機制提供了新的線索，也為之后豬肝臟miRNA的功能研究打下基礎。
　　2糖皮質(zhì)激素處理的肝臟表達譜的分析
　　二花臉新生仔豬血清糖皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇）含量是大白豬的2倍。為了研究糖皮質(zhì)激素對肝臟mRNA表達譜的影響，我們選取了9個GEO上標注比較完備的地塞米松處理的肝臟表達譜并篩選了差異表達基因。其中7個表達譜中下調(diào)基因的數(shù)目大于上調(diào)，僅有兩個與之相反。但是在

7、篩選這些表達譜中共有的差異表達基因時，隨著重復次數(shù)的增加，上調(diào)基因占差異表達基因的比重逐漸增高，這些可能說明了地塞米松對肝臟基因表達的抑制作用是非特異的。
　　將地塞米松處理的肝臟表達譜的上調(diào)和下調(diào)基因分別與二花臉和大白豬的肝臟表達譜的差異表達基因相比較，僅發(fā)現(xiàn)地塞米松下調(diào)的肝臟基因與二花臉豬肝臟下調(diào)基因的交集顯著高于背景值。
　　使用在9個表達譜中存在至少三次重復的上調(diào)基因（178個）和下調(diào)基因(176個)進行GO分析。對

8、糖皮質(zhì)激素處理后肝臟中上調(diào)基因的生物學過程的分析和對全部差異表達基因的分析結果有很大的相似度，但是與下調(diào)基因的生物學過程分析結果有很大不同。這說明只有糖皮質(zhì)激素上調(diào)的基因顯著的被富集在某些生物學通路之中，代表了糖皮質(zhì)激素對肝臟的一般功能。在細胞組分的分析中，可以發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素所上調(diào)的基因最富集的條目是“線粒體”。
　　3糖皮質(zhì)激素對新生仔豬肝臟線粒體功能相關基因表達的調(diào)控
　　線粒體是真核細胞的重要組分，對代謝旺盛的組織如肝

9、臟有著極為重要的作用。不同品種的豬肝臟代謝差異顯著，糖皮質(zhì)激素可能通過影響線粒體功能調(diào)控肝臟代謝，所以我們進而研究了糖皮質(zhì)激素與豬肝臟線粒體功能品種差異的關系。
　　我們比較了大白和二花臉新生仔豬肝臟線粒體基因調(diào)控的品種差異。二花臉豬肝臟ATP含量顯著高于大白豬(p＜0.01)，而線粒體DNA的拷貝數(shù)顯著低于大白豬(p＜0.05)。然而，二花臉豬中大部分線粒體編碼基因（13個中的10個）的表達高于大白豬。另外，我們檢測了三個核編碼

10、的線粒體相關基因的表達，其中二花臉豬肝臟中異檸檬酸脫氫酶2(isocitratedehydrogenase2，IDH2)和ATP合成酶線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運Fo復合物d亞基(ATPsynthase，H+transporting，mitochondrialFocomplex，subunitd，ATP5H)的表達較低，而腺苷酸激酶1（adenylatekinase1，AK1）的表達高于大白豬。二花臉豬線粒體基因調(diào)控區(qū)域糖皮質(zhì)激素受體（glucoco

11、rticoidreceptor,GR）結合顯著高于大白豬(p＜0.01)，這與肝臟線粒體編碼基因的高表達是相關的，而線粒體基因啟動子區(qū)域的甲基化水平不存在品種差異。對于核編碼基因來說，AK1和ATP5H啟動子區(qū)域的GR結合與其mRNA表達方向相反。另外，二花臉豬中高表達的AK1也與其啟動子區(qū)域較低的甲基化(p＜0.05)和羥甲基化水平(p＜0.05)相關。
　　綜上所述，GR對線粒體基因組編碼基因起到了正向的調(diào)控作用，而對核編碼基

12、因ATP5H和AK1的調(diào)節(jié)則是負向的，這些調(diào)控作用可能對兩品種豬肝臟ATP含量的差異有較大的貢獻。
　　4糖皮質(zhì)激素對新生仔豬肝臟miRNA生成關鍵酶的調(diào)控
　　從兩品種新生仔豬肝臟miRNA測序和芯片結果都可以看出，與大白豬相比，二花臉仔豬肝臟上調(diào)的miRNA數(shù)目多于下調(diào)的miRNA，并且miRNA測序庫中二花臉豬總的讀段數(shù)多于大白豬。這些都提示二花臉豬肝臟miRNA生成過程關鍵酶的功能可能高于大白豬。
　　我們比較

13、了大白和二花臉新生仔豬肝臟中Drosha，Dicer和Ago2的mRNA和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)二花臉豬中這三個miRNA生成過程關鍵酶的蛋白表達都顯著高于大白豬，而mRNA水平則不存在差異。對這三個酶轉(zhuǎn)錄層次的調(diào)控因素進行分析顯示，這三個酶啟動子區(qū)域的GR結合，環(huán)腺苷酸應答元件結合蛋白(cAMPresponsiveelement-bindingprotein，CREB)結合，甲基化和羥甲基化情況都不存在差異。這些因素表明，對這三個酶表達的調(diào)控

14、可能主要集中在轉(zhuǎn)錄后層面。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控重要組成部分的miRNA，可能對其自身生成有著很重要的影響。
　　通過實證靶點數(shù)據(jù)與靶點預測信息，我們選取了四個(miR-15b，miR-27a，miR-221與miR-222)在二花臉豬肝臟中低表達的，靶向與miRNA生成過程關鍵酶的miRNA進行進一步研究。糖皮質(zhì)激素對miRNA生成過程關鍵酶表達的調(diào)節(jié)作用在淋巴細胞上有過證明。這四個miRNA也都可能是糖皮質(zhì)激素敏感的miRNA，在糖皮

15、質(zhì)激素處理的情況下可能發(fā)生變化。我們使用real-timePCR驗證了這四個miRNA成熟體和前體的表達，發(fā)現(xiàn)miR-15b和miR-221/222的前體和成熟體在二花臉豬肝臟中的表達都顯著低于大白豬。對這幾個miRNA的啟動子區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄分析可以發(fā)現(xiàn)，二花臉豬肝臟GR對miR-15b和miR-221/222啟動子區(qū)域的結合顯著高于大白，這可能與其表達降低是相關的。我們的結果表明，二花臉新生仔豬肝臟中某些糖皮質(zhì)激素敏感的miRNA的降低