生物學(xué)畢業(yè)論文

1、<p><b>　　引言</b></p><p>　　隱孢子蟲（Cryptosporidium）是細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能感染人與多種動物的消化道和呼吸道而引起隱孢子蟲?。–ryptosporidiosis)[1]。自從Tyzzer[2]在小鼠粘膜組織中發(fā)現(xiàn)小鼠隱孢子蟲(C. muris)以來，隱孢子蟲已經(jīng)被認(rèn)為是世界脊椎動物中的一種廣泛傳播的重要寄生蟲，包括中國在內(nèi)，隱孢子蟲已經(jīng)在世界

2、上六個大洲90個國家發(fā)現(xiàn)[3,4,5]，并經(jīng)常在嬰兒和兒童中發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)今被公認(rèn)的隱孢子蟲有14種，其傳播途徑以卵囊經(jīng)糞-口途徑為主[6,7]。與其它介水傳播性原蟲相比，隱孢子蟲因粒徑小于10 µm和自身對消毒藥的較強(qiáng)抵抗力而被凈水工藝除去的難度更大，即使在濾過水中，卵囊的檢出率在英國和美國分別達(dá)到37%和26%，因此，隱孢子蟲污染已經(jīng)成為水源監(jiān)測的重要指標(biāo)[6,8]。如今，隱孢子蟲能感染包括人在內(nèi)的240多種動物，其中包括野禽、

3、兩棲動物等許多野生動物，是現(xiàn)今引起動物腹瀉的主要病原之一，嚴(yán)重威脅著人和動物的健康，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。</p><p>　　麋鹿屬于國家一級保護(hù)動物，是中國特有的動物，也是世界珍稀動物，曾經(jīng)是國際自然保護(hù)聯(lián)盟IUCN(World Conservation Union）紅皮書規(guī)定的極危物種。目前，雖然世界的麋鹿總數(shù)已經(jīng)繁殖達(dá)4000頭，但仍然是瀕危物種。近幾年來,隱孢子蟲屢次在野生和人工飼養(yǎng)的多種鹿類中發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)

4、重威脅著鹿的健康，而至今未見關(guān)于麋鹿隱孢子蟲病的調(diào)查。因此，積極開展麋鹿隱孢子蟲病的流行病學(xué)調(diào)查，對其防治有著重要的意義。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 樣品采集與保存</p><p>　　從2010年到2011年，應(yīng)用一次性手套，采集北京與大豐麋鹿自然保護(hù)區(qū)自然環(huán)境中新鮮的麋鹿糞便，編號，置于

5、冰壺，并同時(shí)記錄糞便的顏色與性狀。其中，北京采集樣品23個，大豐87個。樣品處理前，4℃低溫保存。</p><p><b>　　1.2 試劑</b></p><p>　　改良抗酸染色液：甲液(石炭酸復(fù)紅4 g，95 %乙醇20 ml，苯酚8 g，雙蒸水100 ml)，乙液(純硫酸10 ml,蒸餾水90 ml)，丙液(0.2 g孔雀綠，蒸餾水100 ml)。飽和鹽水(1

6、000 ml水加熱至沸騰加氯化鈉至不溶為止)。</p><p>　　胎牛血清、甲醇、蒸餾水。</p><p><b>　　1.3 試驗(yàn)材料</b></p><p>　　載玻片、蓋玻片、20 ml試管數(shù)只、試管架、酒精燈、鑷子、一次性手套、口罩、錐形瓶、燒杯、EP管(0.5 ml、0.2 ml、7 ml、10 ml )、移液器、槍頭、記號筆、過濾

7、紗布、漏斗、玻璃棒、標(biāo)簽紙等。</p><p>　　1.4 試驗(yàn)儀器及設(shè)備</p><p>　　光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS-XDS-1B)、數(shù)碼相機(jī)(OLYMPUS)、通風(fēng)櫥(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造)、可調(diào)萬用電爐(龍口市電路制造廠)、電子天平(上海精天電子儀器有限公司)、離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)</p><p><b>　　1.5 試驗(yàn)方法<

8、;/b></p><p>　　通過飽和鹽水漂浮法和改良抗酸染色法來對麋鹿隱孢子蟲卵囊進(jìn)行檢查。具體操作步驟如下所述。</p><p>　　1.5.1 飽和鹽水漂浮法</p><p>　　按編號取麋鹿糞樣3 g于20 ml試管中，將試管依次編號，加入已經(jīng)配制好的飽和鹽水，用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁o置15~30 min后，過濾至已編號的待用試管中。將濾液5 ml一一對應(yīng)

9、倒入已編號的10 ml EP管中，加水適量，放入離心機(jī)，3000 r/ min，離心10 min。取出棄掉上清液，用移液器取5 ml蒸餾水加入與管內(nèi)離心剩余物充分混勻，重復(fù)以上離心步驟。取出后棄去上清液，用移液器取200 μl蒸餾水與離心產(chǎn)物混勻，取出放入500 μl EP管中置于4℃冰箱中保留備樣。</p><p>　　用移液器取2 μl牛血血清與載玻片上，按編號依次取20μl漂浮液與之混合，蓋上蓋玻片，40倍

10、物鏡鏡檢。</p><p>　　1.5.2 改良抗酸染色法 </p><p>　　按編號取麋鹿糞樣3 g于20 ml試管中，將試管依次編號，加入已經(jīng)配制好的飽和鹽水，用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁o置15~30 min后,過濾至已編號的待用試管中。之后，將過濾液5 ml一一對應(yīng)倒入已編號的10 ml EP中，加水適量，放入離心機(jī)離心，要求轉(zhuǎn)速3000 r/ min,離心10 min后，取出棄掉上清液，

11、用移液器取5 ml蒸餾水加入與管內(nèi)離心剩余物充分混勻，之后再重復(fù)以上離心步驟。取出后棄去上清液，用移液器取200 μl蒸餾水與離心產(chǎn)物混勻，之后取出放入500 μl EP管中置于4℃冰箱中保留備樣。</p><p>　　用移液器取2 μl牛血血清與載玻片上，按編號依次取20 μl漂浮液與之混合，涂成直徑約為1 cm大小的圓，用標(biāo)簽紙將載玻片編號，待其自然干燥后，用酒精燈進(jìn)行固定，之后進(jìn)行染色。先用甲液染色5 mi

12、n，水洗，再滴加乙液，脫色2~5 min，水洗之后，再滴加丙液30 s，之后水洗晾干即可鏡檢。</p><p><b>　　1.6 檢測指標(biāo)</b></p><p>　　1.6.1麋鹿隱孢子蟲的感染強(qiáng)度 </p><p>　　隱孢子蟲感染強(qiáng)度的判定主要是根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)資料的判定標(biāo)準(zhǔn),并做相應(yīng)的改進(jìn)。用40倍物鏡觀察每個糞樣的3張涂片，發(fā)現(xiàn)卵囊即為

13、陽性。1-5 個卵囊表示為“+”， 6-10 個卵囊為“++”， 11-15個卵囊為“+++”，16-20個卵囊為“++++”，>20卵囊為“+++++”。未發(fā)現(xiàn)卵囊者為陰性“-”。</p><p>　　1.6.2蟲種的形態(tài)學(xué)觀察 </p><p>　　隨機(jī)選擇6個分離株分離純化的卵囊，在光學(xué)顯微鏡下，分別測量10個卵囊的長、短徑，計(jì)算卵囊指數(shù)，將卵囊指數(shù)和所測長短徑值，并觀察隱孢子

14、蟲卵囊的染色特征和直接鏡檢時(shí)的內(nèi)部形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。</p><p><b>　　1.7 統(tǒng)計(jì)分析</b></p><p>　　試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 12.0和Microsoft Office Excel 2003軟件，陽性率和發(fā)生率的比較采用χ2檢驗(yàn)(α=0.05)。</p><p><b>　　2 結(jié)果與分析</b&

15、gt;</p><p>　　2.1麋鹿隱孢子蟲卵囊形態(tài)學(xué)</p><p>　　卵囊在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，可見卵囊呈圓形、扁圓形或橢圓形，卵囊最外層有一薄的卵囊壁，卵囊內(nèi)部結(jié)構(gòu)有呈月牙形的子孢子，圓點(diǎn)狀的殘留體 (圖1)。經(jīng)MAFS染色的卵囊呈圓形、扁圓形或橢圓形，外有一層透明的卵囊壁，在黃綠色或藍(lán)綠色背景下，卵囊呈粉紅色到鮮艷的玫瑰紅色 (圖2)。</p><p&g

16、t;　　圖1 圖2</p><p>　　圖1 40倍普通光學(xué)顯微鏡下，飽和鹽水漂浮法分離純化的麋鹿隱孢子蟲卵囊，米粒樣大小。</p><p>　　圖2 在40倍普通光學(xué)顯微鏡下，經(jīng)MAFS染色的麋鹿糞樣的隱孢子蟲卵囊，在藍(lán)綠色背景下呈粉紅色至鮮艷的玫瑰紅色。</p><p>　　2.2麋鹿隱孢子蟲卵的大小

17、</p><p>　　在100倍物鏡下，隱孢子蟲卵囊長徑在4.78μm-4.94μm之間，短徑在4.08μm-4.37μm之間，卵囊指數(shù)在1.12 到1.18之間。</p><p>　　2.3 麋鹿隱孢子蟲感染</p><p>　　圖3 不同季節(jié)麋鹿隱孢子蟲的感染率</p><p>　　2.3.1 感染率和感染強(qiáng)度</p>&l

18、t;p>　　在采集的110份麋鹿糞樣中，12份檢測到隱孢子蟲卵囊，總陽性率為10.90%。在所有的12份陽性樣品中，感染強(qiáng)度“+”和“++”的有10個和2個，分別占了總感染率的83.33 %和16.67%。北京地區(qū)檢出的陽性率為8.70%（2/23），大豐地區(qū)檢出的陽性率為11.49%（10/87），感染率之間差異不顯著(χ2=0.13，P>0.05)。</p><p>　　2.3.2感染的季節(jié)性&l

19、t;/p><p>　　從春季到冬季，麋鹿隱孢子蟲的感染率分別為6.25%(1/16)、12.00%(3/25)、17.39%(4/23)和8.70%(4/46)，如圖3所示。各季節(jié)感染率之間差異不顯著(χ2=0.0-1.99，P>0.05)。</p><p><b>　　3結(jié)論與討論</b></p><p>　　3.1 麋鹿隱孢子蟲病的檢測方

20、法的可行性</p><p>　　3.1.1 飽和鹽水漂浮法</p><p>　　本法為寄生蟲病實(shí)驗(yàn)室檢查的常規(guī)方法之一，本文在常規(guī)飽和鹽水漂浮法的基礎(chǔ)上，取上清液于離心機(jī)中進(jìn)行兩次離心，使糞便中蟲卵囊充分沉淀，保證足夠的卵囊數(shù)量，便于鏡檢和提高隱孢子蟲卵囊檢出率。 </p><p>　　3.1.2 改良抗酸染色法 </p><p>　　抗酸染

21、色原理已經(jīng)研究得較為透徹，一般認(rèn)為抗酸性菌體或蟲卵內(nèi)含脂類物質(zhì)較多(含量可高達(dá)40% ) ，此物質(zhì)具抗酸的性質(zhì)。染色時(shí)，它與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性酒精的脫色作用，同時(shí)脂類又不易過細(xì)胞膜,不能被脫色，因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色。相反,非抗酸性菌體內(nèi)含脂類少，易被酸酒精脫色 ，脫色時(shí)又易從細(xì)胞膜滲出而脫掉,最后被復(fù)染成藍(lán)綠色。隱孢子蟲卵囊內(nèi)的脂類含量較高，其中孢子化小球隱孢子蟲卵囊大約含有1.2×10-9 μmol磷脂，卵

22、磷脂占66%，對抗酸染色法具有特異性和敏感性。經(jīng)抗酸染色、脫色等步驟后，卵囊被染成玫瑰紅色，隱孢子蟲卵囊被染成紫紅色或玫瑰紅色，背景為藍(lán)綠色。卵囊圓形或橢圓形，直經(jīng)2~3 μm。仔細(xì)觀察，有的卵囊可見到子孢子，該染色法較為常用，效果尚好。但由于染色和脫色時(shí)間不同，卵囊著色結(jié)果不完全一致，有些卵囊著色深，結(jié)構(gòu)清晰，有些卵囊染色淡，結(jié)構(gòu)模糊，如果被檢驗(yàn)的材料保存時(shí)間較長，2~3 d以后，則卵壁染色不均，卵囊像半月形，細(xì)胞僅部分著色。涂片在硫

23、酸里不充分脫色時(shí)，菌叢、酵母和真菌也可能染成玫瑰紅色，但它們內(nèi)無結(jié)構(gòu)，可根據(jù)它們的形態(tài)和大小與隱抱子蟲卵囊相區(qū)別。通常情況下</p><p>　　3.1.3 兩種方法結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)</p><p>　　在本文對麋鹿隱孢子蟲病檢測的研究中，將飽和鹽水漂浮法和抗酸染色法兩種方法結(jié)合起來，方法確實(shí)，便于鏡檢和提高隱孢子蟲卵囊的檢出率。能夠發(fā)現(xiàn)和區(qū)分隱孢子蟲卵囊在兩種狀態(tài)下的形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高了試驗(yàn)的檢出

24、效率。</p><p>　　3.2 麋鹿隱孢子蟲感染 </p><p>　　3.2.1 麋鹿隱孢子蟲感染的地域性</p><p>　　本研究發(fā)現(xiàn)，在采集的110份麋鹿糞樣中，12份檢測到麋鹿隱孢子蟲卵囊，其中北京地區(qū)檢出的陽性率低于大豐地區(qū)檢出的陽性率，二者之間差異不顯著。說明，麋鹿隱孢子蟲感染無地域性。</p><p>　　3.2.2 麋鹿

25、隱孢子蟲感染率與季節(jié)的關(guān)系</p><p>　　Yu等(2004)報(bào)道認(rèn)為隱孢子蟲感染率夏季（22.1%）高于冬季（12.7%）[9]，Chai等[10]除報(bào)到春天明顯高于夏季和冬季，而且此季節(jié)性與溫度不相關(guān)，而與降雨量存在一定的相關(guān)性；而Sanford等報(bào)道沒有發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染的季節(jié)性[11]。與這些報(bào)道不同的是，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染率秋季最高，春季最低，各季節(jié)感染率之間差異不顯著。因此，感染無季節(jié)性。&l

26、t;/p><p>　　3.2.3 麋鹿隱孢子蟲的感染強(qiáng)度</p><p>　　本研究發(fā)現(xiàn)，在采集的110份麋鹿糞樣中，12份檢測到隱孢子蟲卵囊，總陽性率為10.90%。在所有的12份陽性樣品中，感染強(qiáng)度主要是低強(qiáng)度感染。由此提示，麋鹿感染隱孢子蟲病廣泛存在，但是大多數(shù)的感染強(qiáng)度是較低的。</p><p><b>　　4 小結(jié)</b></p&g

27、t;<p>　　本文應(yīng)用改良抗酸染色法對大豐地區(qū)和北京地區(qū)麋鹿隱孢子蟲病流行病學(xué)情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大豐地區(qū)和北京地區(qū)存在麋鹿隱孢子蟲病的感染率較高，但是大多數(shù)感染強(qiáng)度較低，發(fā)生無季節(jié)性和地域性。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　兩年的本科學(xué)習(xí)生涯馬上就要畫上句號了，畢業(yè)前所有的努力與付出都凝聚在這篇論文里面。相信它雖然算不上

28、上乘之作，但的確是我用心血澆灌的答卷。</p><p>　　本文是在指導(dǎo)老師xx老師的悉心指導(dǎo)下完成的。從試驗(yàn)的選題、設(shè)計(jì)到論文的撰寫無不凝聚著老師的心血，在此過程中，xx老師始終給予精心的指導(dǎo)和無微不至的關(guān)懷。xx老師熱情隨和、治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、見識廣、胸懷寬廣，他淵博的學(xué)識、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、開闊的科研思路使我受益終生，在此謹(jǐn)向xx老師表示衷心的感謝！</p><p>　　本篇畢業(yè)論文的寫作也得

29、到了青島農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)專業(yè)各位師兄師姐的熱情幫助。感謝在整個畢業(yè)設(shè)計(jì)期間和我密切合作的同學(xué)，和曾經(jīng)在各個方面給予過我?guī)椭幕锇閭?，在此，我再一次真誠地向幫助過我的老師和同學(xué)表示感謝！</p><p>　　同時(shí)，也感謝xx臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室為我提供良好的做畢業(yè)設(shè)計(jì)的環(huán)境。 </p><p>　　最后，再一次感謝所有在畢業(yè)設(shè)計(jì)中曾經(jīng)幫助過我的良師益友和同學(xué)，以及在設(shè)計(jì)中被我引用或參考的論著的作者

30、。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Widmer G, Feng X, Tanriverdi S. Genotyping of Cryptosporidium parvum with microsatellite markers. Methods Mol Biol , 2004, 268:177-87</p>

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