利用柑橘愈傷組織研究植物類胡蘿卜素積累的調(diào)控機(jī)理.pdf

1、類胡蘿卜素是自然界中常見的物質(zhì)，是植物生存必需的次生代謝物。它參與眾多生物學(xué)過程，對人類健康及動(dòng)植物生存具有重要意義，它賦予花卉果實(shí)豐富色彩，有利于授粉和種子傳播。因此，深入理解植物中類胡蘿卜素的代謝調(diào)控機(jī)制有助于我們更好地利用類胡蘿卜素，使其服務(wù)于我們的生活。
　　柑橘愈傷組織本身含有多種類胡蘿卜素，又因其生長周期短、培養(yǎng)條件簡易可控等特點(diǎn)，使之成為植物類胡蘿卜素代謝研究的較理想材料。本研究通過多種外界因素處理柑橘愈傷組織，包括

2、光暗、除草劑、生長周期、糖分和激素處理，深入分析了不同因素對柑橘愈傷組織中類胡蘿卜素代謝調(diào)控特征及類胡蘿卜素代謝同其它生物學(xué)過程的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　1、對紅馬敘葡萄柚(Red Marsh grapefruit)（Citrus paradisi Macf.）、默科特橘橙(Murcott tangor)（C.reticulata×C sinenis、塔羅科血橙（Tarocco blood orange）(C.sinensi

3、s[L.]Osbeck)和冰糖橙甜橙(Bingtangchengsweetorange)(Csinensis[L.]Osbeck)4種柑橘胚性愈傷組織進(jìn)行光照/黑暗處理。HPLC和Real-TimePCR分析表明，光照對柑橘愈傷組織中類胡蘿卜素的調(diào)控模式因受基因型影響呈現(xiàn)多樣性。在光照條件下，紅馬敘葡萄柚愈傷組織中類胡蘿卜素的合成受阻;而塔羅科血橙愈傷組織中類胡蘿卜素受光照誘導(dǎo)積累。環(huán)氧類胡蘿卜素的光穩(wěn)定性強(qiáng)于非環(huán)氧類胡蘿卜素，如花藥黃

4、質(zhì)和紫黃質(zhì)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PSY是2種甜橙愈傷組織中類胡蘿卜素合的限速基因;而在默科特橘橙愈傷組織中，光照強(qiáng)烈誘導(dǎo)CRTISO的表達(dá)。
　　2、CPTA是胡蘿卜素環(huán)化酶抑制劑，用0.2％(w/v)濃度處理紅馬敘愈傷組織，結(jié)果表明CPTA不僅能有效地促進(jìn)類胡蘿卜素（特別是番茄紅素）的合成積累，還能刺激一些次生代謝物的合成，例如類黃酮和生物堿類物質(zhì)，但對初生代謝物的生物合成影響不大。利用基因芯片分析處理前后愈傷組織中轉(zhuǎn)錄水平上的差異，

5、其中33個(gè)基因上調(diào)，90個(gè)基因下調(diào)。這些基因包括編碼過氧化物酶、抗逆相關(guān)基因和P450等。同時(shí)，檢測到過氧化氫(H2O2)、JA、SA和ABA含量下降。本研究認(rèn)為，紅馬敘愈傷組織在CPTA的刺激下產(chǎn)生大量抗氧化性物質(zhì)（特別是類胡蘿卜素和類黃酮）并可能通過非酶促反應(yīng)緩解了細(xì)胞內(nèi)的氧化脅迫，避免了激活由激素介導(dǎo)的抗逆機(jī)制。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)CPTA處理后IAA的增加可能是引起類胡蘿卜素總量激增的部分原因。
　　3、利用基因芯片對自然生長

6、狀態(tài)下(10DAC和30DAC)的愈傷組織進(jìn)行分析。結(jié)果表明，共有2505個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)1154個(gè)，下調(diào)1351個(gè)，并利用Real-TimePCR的方法對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。初生代謝組分析表明大部分可溶性糖和有機(jī)酸的含量顯著下降，而氨基酸和脂類含量變化不大，這暗示愈傷組織在生長后期缺乏碳水化合物提供能量。結(jié)合芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，糖分的匱乏可能引起TCA循環(huán)的加速以彌補(bǔ)能量供給不足，同時(shí)可能與抗氰呼吸清除細(xì)胞內(nèi)自由基有關(guān);而碳鏈

7、在逆境環(huán)境下有向次生代謝物流動(dòng)的趨勢。在生長后期，伴隨類胡蘿卜素含量急劇的減少，類胡蘿卜素合成相關(guān)基因顯著上調(diào)，說明類胡蘿卜素含量的降低可能是多因素導(dǎo)致。H2O2含量的增加也表明愈傷組織受到氧化脅迫。本研究認(rèn)為，生長后期糖匱乏可能引起了愈傷組織中H2O2含量的增加，而H2O2對類胡蘿卜素的積累有一定影響，同時(shí)糖分和激素對類胡蘿卜素合成的調(diào)控有待深入研究。
　　4、在培養(yǎng)基中添加不同濃度蔗糖或葡萄糖，以研究糖分對類胡蘿卜素調(diào)控的作用

8、。結(jié)果表明，外源糖分能刺激愈傷組織中類胡蘿卜素的合成，但在較高糖分濃度下，類胡蘿卜素的合成受到抑制。Real-TimePCR分析表明外源糖分并不能誘導(dǎo)類胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)，60mM葡萄糖甚至?xí)种祁惡}卜素合成相關(guān)基因表達(dá)。但外源糖分能明顯誘導(dǎo)糖轉(zhuǎn)運(yùn)及糖信號基因的表達(dá)，如SUT,TMT和HXK，說明糖可能是愈傷組織中類胡蘿卜素合成的信號因子。
　　5、使用外源植物激素ABA、IAA、GA和JA分別處理紅馬敘愈傷組織12h，3

9、d和10d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理3d和10d后類胡蘿卜素積累普遍顯著性升高，其中以IAA的效果最為顯著。隨著處理時(shí)間的延長，激素對類胡蘿卜素的刺激作用略有降低，但仍高于對照。Real-TimePCR分析結(jié)果表明，不同激素對類胡蘿卜素轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式存在差異。而對激素相關(guān)基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族的基因AGL6可能與類胡蘿卜素合成有關(guān)。
　　綜上所述，本研究對理解植物類胡蘿卜素代謝的生物學(xué)本質(zhì)具有重要價(jià)值，對類胡蘿卜