改性酵母葡聚糖的制備及其作為免疫增強劑在兩種甲殼動物上的應用.pdf

1、酵母葡聚糖是水產養(yǎng)殖中使用最廣泛的免疫增強劑。但是目前的研究表明，葡聚糖的不溶解性不利于其免疫增強作用的發(fā)揮。為了增加酵母葡聚糖的溶解性，本研究共制備了8種酵母葡聚糖衍生物，即4種不同取代度的羧甲基葡聚糖和4種不同取代度的磺乙基葡聚糖。將葡聚糖和8種衍生物分別按照5、25和100μg/mL的濃度分別添加到原代培養(yǎng)凡納濱對蝦血細胞的培養(yǎng)液中。以空白血細胞作為對照。孵育6h、12h和24h后分別取樣，測定血細胞的酚氧化酶和呼吸爆發(fā)活力。結果

2、表明，在6h時，所有葡聚糖衍生物處理組的酚氧化酶活力均顯著高于相同濃度下的未衍生葡聚糖處理組（P<0.05）。而25μg/mL酵母葡聚糖衍生物處理組的呼吸爆發(fā)活力顯著高于同濃度未經衍生葡聚糖處理組（P<0.05）。在12h時，所有酵母葡聚糖衍生物處理組的酚氧化酶和呼吸爆發(fā)活力均顯著高于未衍生葡聚糖處理組（P<0.05）。在6h和12h時，同濃度各葡聚糖衍生物處理組的血細胞酚氧化酶和呼吸爆發(fā)活力并無顯著差異（P>0.05）。研究結果表明，

3、羧甲基葡聚糖和磺乙基葡聚糖均比未衍生葡聚糖具有更強的免疫促進作用，而且這種免疫促進作用在兩種衍生物之間沒有顯著差異；另一方面，酵母葡聚糖衍生物的免疫促進作用與其使用濃度有關，而與其取代度沒有明顯的關系。
　　將葡聚糖及其8種衍生物分別按照1g/kg和2g/kg兩種濃度添加到凡納濱對蝦飼料中，制備18種實驗飼料。將這些飼料投喂給凡納濱對蝦（平均體重0.65g），飼養(yǎng)30天，取樣測定免疫指標并用白斑病病毒攻毒，用以比較各免疫增強劑的免

4、疫增強作用和免疫保護力。對于飼喂羧甲基葡聚糖的對蝦，其總血細胞數(shù)、酚氧化酶活力、呼吸爆發(fā)活力、超氧化物歧化酶活力和攻毒后存活率顯著受到取代度的影響，且隨取代度的升高而下降。與羧甲基葡聚糖不同，磺乙基葡聚糖不能提高凡納濱對蝦血細胞數(shù)?；且一暇厶堑娜〈蕊@著影響了凡納濱對蝦呼吸爆發(fā)活力。包含有1g/kg的葡聚糖衍生物的飼料比含有2g/kg的同一衍生物的飼料能顯著的提高凡納濱對蝦的免疫力和抗病力。攝食含有1g/kg，取代度為0.352的羧甲

5、基葡聚糖的凡納濱對蝦表現(xiàn)出最高的免疫力和抗病力。這種羧甲基葡聚糖可以作為更高效的凡納濱對蝦免疫增強劑。
　　之前的研究表明，一些基因缺陷型酵母比野生型酵母具有更強的免疫促進作用。但是，基因缺陷型酵母的最適使用時間至今仍然未見報道。本研究選取兩種基因缺陷型酵母（Mnn9和Chs3基因缺失酵母），連同野生型酵母（WT）在坎貝氏弧菌攻毒前48、24或12小時前分別投喂給鹵蟲。以攻毒后鹵蟲的存活率和酚氧化酶基因表達評價酵母種類和酵母投喂時

6、間對于其的免疫保護和免疫促進作用的影響。實驗結果表明，在任何時間點投喂野生型酵母都不能保護鹵蟲免受坎貝氏弧菌侵襲。攻毒前12小時投喂基因缺陷型酵母可以在一定程度上保護鹵蟲。延長投喂時間，并不能顯著提高其免疫保護力。Mnn9和Chs3酵母的免疫保護力并沒有顯著差異?；虮磉_實驗的結果表明，未攻毒時，所有酵母都不能影響酚氧化酶原基因的表達。但是，攻毒后12和24小時，基因缺陷型酵母可以提高酚氧化酶原基因的表達。本研究表明，攻毒前12小時使用

7、基因缺陷型酵母即起到一定的預防疾病的效果。
　　基于之前的研究，我們推測不同基因缺陷型酵母免疫保護力不同可能與其細胞壁的葡聚糖的性質有關。為了驗證我們的推測，并為研究葡聚糖構象與功能的關系提供參考資料，我們從幾種基因缺陷型酵母（Mnn9、Chs3、Gas1）和野生型酵母（WT）提取葡聚糖，并將購買于Sigma公司的酵母葡聚糖作為比照。將這5種葡聚糖投喂給無菌培養(yǎng)鹵蟲。12小時后，用坎貝氏弧菌攻毒，攻毒后于12、24、48和72小時