外源亞精胺緩解黃瓜幼苗高溫脅迫傷害的生理調(diào)節(jié)機制和蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、高溫脅迫對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的威脅是一個全球性的熱點問題，嚴重影響著作物的生育和產(chǎn)量。黃瓜（Cucumis sativus L.）是世界性的重要蔬菜作物，也是我國設(shè)施栽培的主要蔬菜種類之一。然而，在我國大部分地區(qū)的保護設(shè)施中，正午40℃以上的高溫經(jīng)常出現(xiàn)，高溫熱害已經(jīng)成為黃瓜夏秋露地與保護地栽培的主要限制因子。多胺(Polyamines，PAs)是生物代謝過程中產(chǎn)生的一類具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，廣泛作用于植物生長、形態(tài)建成、衰老和對逆

2、境脅迫的響應(yīng)。多胺的種類主要包括二胺類的腐胺（Putrescine，Put）、三胺類的亞精胺(Spermidine，Spd)和四胺類的精胺（Spermine，Spm）。近年來，通過使用外源多胺類物質(zhì)來調(diào)節(jié)和介導(dǎo)植物各種脅迫耐性的研究越來越多。然而，關(guān)于多胺調(diào)節(jié)蔬菜作物高溫脅迫的生理研究比較少見，尤其是蛋白質(zhì)組學方面的研究尚為空白。
　　 本研究以黃瓜品種‘津春4號’為試材，在人工氣候箱內(nèi)，采用營養(yǎng)缽內(nèi)石英砂澆灌營養(yǎng)液栽培的方式，

3、通過葉面噴施外源1 mM Spd，測定了高溫脅迫(42℃/32℃)下黃瓜植株生長、光合與熒光特性、葉綠體超微結(jié)構(gòu)、膜脂過氧化程度、活性氧清除酶活性和同工酶表達、抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)、氮素吸收代謝等方面的變化，研究了黃瓜葉片可溶性蛋白變化和蛋白質(zhì)組功能、mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，探討了外源Spd提高黃瓜植株耐熱性的生理和分子生物學機制。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.外源Spd對高溫脅迫下黃瓜幼苗生長和內(nèi)源多胺含量的影響:高溫脅迫下

4、，黃瓜幼苗生長受到明顯抑制，株高、莖粗、地上部干鮮重、地下部干鮮重及主要功能葉的葉面積均顯著降低，外源Spd處理可明顯緩解高溫脅迫對黃瓜幼苗生長的抑制，提高植株生物量的積累。高溫脅迫下，黃瓜幼苗葉片中游離態(tài)、結(jié)合態(tài)和束縛態(tài)Put含量顯著降低，而游離態(tài)、結(jié)合態(tài)和束縛態(tài)Spd和Spm含量顯著升高。從多胺種類上來看，黃瓜幼苗體內(nèi)三種形態(tài)Put均向Spd和Spm的轉(zhuǎn)化可能是黃瓜幼苗（至少是該品種）對高溫脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)。噴施外源Spd處理促

5、進葉片中Put和Spd含量的升高，而Spm含量略有下降，由于Put是Spd的上游產(chǎn)物而Spm是Spd的下游產(chǎn)物，外源Spd的作用即趨向于維持高水平的內(nèi)源Spd含量。
　　 2.外源Spd保護高溫脅迫下黃瓜幼苗的光合能力:與常溫對照相比，高溫脅迫下葉綠素含量和凈光合速率顯著下降，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率升高，PSⅡ潛在最大光化學效率及實際光化學效率亦明顯下降;高溫脅迫下施用外源Spd有助于提高葉片光合色素的含量，維持較高的凈光合速率及P

6、SⅡ光化學效率。單純高溫脅迫下，葉綠體內(nèi)淀粉粒膨大并大量積累、基粒片層受到擠壓且數(shù)目相對減少，嗜鋨體大量出現(xiàn);高溫脅迫下噴施外源Spd，葉綠體超微結(jié)構(gòu)幾乎未受到影響。Spd對葉綠體結(jié)構(gòu)與功能的維持和保護，可能是其改善黃瓜幼苗在高溫脅迫下光合能力的主要原因，由此而增強植株對高溫逆境的適應(yīng)性。外源Spd可有效抑制高溫脅迫下淀粉的水解，使糖分趨于向合成方向，積累更多的干物質(zhì)。
　　 3.外源Spd增強高溫脅迫下黃瓜幼苗的抗氧化能力:高

7、溫脅迫下，黃瓜幼苗葉片膜脂過氧化程度顯著加劇，表現(xiàn)為葉片相對電導(dǎo)率、MDA含量及脂氧合酶(LOX)活性以及ROS水平（包括O2-和H2O2含量）均顯著上升;而外源Spd處理可明顯抑制高溫脅迫下幼苗葉片的膜脂過氧化損傷，降低ROS水平，減少電解質(zhì)滲漏和MDA積累。高溫脅迫下，SOD活性大幅下降，POD和APX活性先升高后降低，CAT活性先降低后升高，這些酶的同工酶也發(fā)生明顯的變化;外源Spd顯著增強了高溫脅迫下SOD活性，POD、CAT和

8、APX活性也有不同程度的提高，除對POD同工酶影響較小外，外源Spd明顯促進了其他保護酶同工酶的表達。AsA-GSH循環(huán)中，高溫脅迫誘導(dǎo)MDAR、DHAR和GR活性升高，還原型抗氧化劑AsA和GSH含量上升且氧化還原比例發(fā)生變化;外源Spd處理進一步提高MDAR、DHAR和GR活性，在促進還原型抗氧化劑AsA和GSH絕對含量升高的同時，還提高了還原型抗氧化劑所占比例（AsA/DHA、GSH/GSSG）。黃瓜幼苗在高溫脅迫下啟動自身的抗氧

9、化系統(tǒng)以抵御高溫造成的氧化傷害，但隨著脅迫時間的延長，這種抵御逐漸減弱，而外源Spd能顯著降低高溫脅迫造成的膜脂過氧化傷害，提高抗氧化酶活性并增強同工酶表達，活化AsA-GSH循環(huán)，促進了黃瓜幼苗整體抗氧化能力的提高。
　　 4.外源Spd對高溫脅迫下黃瓜幼苗氮素和其他代謝的影響:高溫脅迫下，幼苗根系中NO3--N含量升高但隨脅迫處理時間的延長向地上部運輸受阻，根系中硝酸還原酶(NR)鈍化，葉片中NR活性升高，根系和葉片中NH4

10、+-N含量大幅上升;外源Spd能有效調(diào)節(jié)高溫脅迫下氮素代謝的平衡，促硝抑銨，提高NR活性。脯氨酸是一種重要的含氮化合物，逆境條件下較高的脯氨酸水平可增強植株的滲透調(diào)節(jié)能力，有助于維持植株體內(nèi)的水分平衡。高溫脅迫下，黃瓜幼苗葉片內(nèi)脯氨酸含量升高，外源Spd進一步促進其含量的升高，從而為黃瓜幼苗在高溫脅迫下生長發(fā)育提供額外的滲透調(diào)節(jié)能力。高溫脅迫下，質(zhì)膜蛋白含量降低而液泡膜蛋白含量升高，質(zhì)子泵活性略有升高;外源Spd可進一步提高高溫脅迫下黃

11、瓜幼苗葉片質(zhì)膜和液泡膜H+-ATPase，而液泡膜H+-PPase活性略有下降。外源Spd促進H+-ATPase的活性，從而穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，建立跨膜質(zhì)子推動力△pH，促進ATP的產(chǎn)生和維持細胞質(zhì)酸堿平衡，緩解了高溫脅迫對黃瓜幼苗生長的抑制。
　　 5.外源Spd對高溫脅迫下黃瓜幼苗葉片蛋白質(zhì)組和基因表達的影響:高溫脅迫初時，幼苗葉片可溶性蛋白含量升高，隨脅迫時間延長至5d后，葉片可溶性蛋白含量開始下降，外源Spd可顯著提高葉片可溶性

12、蛋白的含量。利用雙向電泳（2-DE）和質(zhì)譜分析(LC-ESI-MS/MS)的技術(shù)，比較常溫對照和高溫脅迫及外源Spd處理的幼苗葉片2-DE圖譜，共發(fā)現(xiàn)62個差異表達蛋白點，其中有60個蛋白點成功得以MS鑒定。經(jīng)功能分類后顯示，25個蛋白點與光合作用有關(guān)，16個蛋白點涉及能量與物質(zhì)代謝，6個蛋白點為分子伴侶，6個蛋白點與脅迫防御有關(guān)，7個蛋白點與蛋白質(zhì)或核酸的生物合成相關(guān)，另有2個蛋白點因MS鑒定得分較低或EST功能尚不明確而被歸為功能未

13、知蛋白。主要差異蛋白有Rubisco大/小亞基、Rubisco活化酶(RCA)、轉(zhuǎn)酮醇酶(TK)、磷酸核酮糖激酶(PRK)、熱激蛋白70(HSP70)、分子伴侶60(CPN60)、Cu/Zn-SOD、類胡蘿卜素相關(guān)蛋白、蛋白翻譯延長因子（EF-Ts和EF-G）等。高溫脅迫對光合作用、能量和物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的影響最為明顯，而外源Spd處理在蛋白質(zhì)水平上表現(xiàn)出積極的保護作用，尤其是顯著提高了部分高溫下調(diào)蛋白（如Rubisco大/小亞基和Cu