基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的光皮樺應(yīng)拉木形成分子機(jī)制研究.pdf

1、光皮樺（Betula luminifera）既是優(yōu)先推廣的優(yōu)質(zhì)珍貴用材樹(shù)種，也是林木遺傳研究的理想材料。材性改良是現(xiàn)階段光皮樺育種的重要內(nèi)容之一，然而同其他樹(shù)種一樣，如何縮短其選擇周期，加快遺傳改良進(jìn)程，是急需解決的難題。該問(wèn)題的解決有賴(lài)于對(duì)其木材品質(zhì)性狀遺傳基礎(chǔ)的了解和掌握程度。近年來(lái)，一種基于第二代測(cè)序平臺(tái)的RNA-Seq技術(shù)已被成功應(yīng)用于非模式木本植物重要性狀關(guān)鍵候選基因的挖掘和分子機(jī)制的解析。本論文在原有工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究明

2、確光皮樺應(yīng)拉木的特殊材質(zhì)表型及其與內(nèi)源激素分布的關(guān)系;同時(shí)應(yīng)用RNA-Seq深度分析轉(zhuǎn)錄組特征和應(yīng)拉木形成早期階段的基因表達(dá)模式，挖掘與木材材性形成聯(lián)系的關(guān)鍵候選基因。其主要結(jié)果如下:
　　 1.光皮樺經(jīng)40天的拉彎處理，應(yīng)拉區(qū)木質(zhì)部的細(xì)胞壁明顯增厚，纖維平均雙壁厚是對(duì)應(yīng)木的1.5倍，形成了明顯的膠質(zhì)纖維層。應(yīng)拉木的平均纖維長(zhǎng)度、纖維素含量均明顯大于對(duì)應(yīng)木，而木質(zhì)素含量則表現(xiàn)相反。3個(gè)處理時(shí)間應(yīng)拉木中蔗糖、果糖含量皆高于對(duì)應(yīng)木和

3、直立木的數(shù)值，說(shuō)明應(yīng)拉木形成早期階段碳流已朝纖維素合成方向轉(zhuǎn)變。同階段應(yīng)拉區(qū)IAA含量皆小于對(duì)應(yīng)區(qū)，但僅處理7天的木質(zhì)部樣品兩區(qū)塊間差異達(dá)到顯著水平。GA和BR也表現(xiàn)出與IAA類(lèi)似的變化規(guī)律。而ZR含量在兩區(qū)塊木質(zhì)部間皆無(wú)明顯差異，但表現(xiàn)出隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)?？梢?jiàn)，IAA等激素的重新分布可能不是導(dǎo)致光皮樺應(yīng)拉木形成的起始因素。
　　 2.利用Illumina的Hiseq2000平臺(tái)對(duì)光皮樺8種組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了深度測(cè)序，

4、總共獲得2.1×107個(gè)Reads，產(chǎn)生1.9 Gbp的序列數(shù)據(jù)。經(jīng)拼接得到54，777個(gè)Unigenes，平均長(zhǎng)度443 bp，總堿基數(shù)達(dá)24.20Mb。通過(guò)與NR和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，65.8％(35，920)的Unigenes得到了注釋信息，涉及24，482個(gè)不重復(fù)的蛋白序列號(hào)。同時(shí)，7，954和9，997個(gè)Unigenes分別獲得了GO和COG分類(lèi)信息，且15，427個(gè)Unigenes被匹配到125個(gè)代謝通路。通過(guò)

5、基因名搜索和序列比對(duì)，19個(gè)參與纖維素、木質(zhì)素合成途徑酶的編碼基因被鑒定，而且其中多數(shù)基因在光皮樺基因組中表現(xiàn)為多成員家族。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的結(jié)果，15個(gè)參與纖維素、木質(zhì)素合成基因的全長(zhǎng)cDNA被克隆。經(jīng)序列比對(duì)，28個(gè)Unigenes覆蓋了這些目標(biāo)基因的不同區(qū)域，且序列一致性達(dá)96.0％以上。進(jìn)一步的定量PCR分析不僅驗(yàn)證了15個(gè)目標(biāo)基因存在的真實(shí)性，而且表達(dá)模式結(jié)果能基本匹配相應(yīng)功能注釋信息。本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的序列信息為光皮

6、樺后續(xù)功能基因組研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 3.以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的相關(guān)序列為基礎(chǔ)，利用RACE技術(shù)分離到8個(gè)光皮樺纖維素合成酶基因BlCesA的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)應(yīng)的編碼蛋白分別由985-1,103個(gè)氨基酸殘基組成，且每個(gè)蛋白都具有植物CESA蛋白特有的基序。8個(gè)BlCESA氨基酸序列間一致性交幅為55-82％，而它們與相應(yīng)具最高相似度的毛果楊PtriCESA氨基酸序列間的一致性高達(dá)81-92％。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分析發(fā)現(xiàn)BlCESA

7、1、BlCESA3和BlCESA4分屬于3個(gè)與次生壁形成相關(guān)的類(lèi)群;BlCESA2、BlCESA5、BlCESA6、BlCESA7和BlCESA8則分屬于3個(gè)與初生壁形成相關(guān)的類(lèi)群。進(jìn)一步的定量PCR分析，表明BlCesA1、BlCesA3和BlCesA4等3個(gè)基因主要在木質(zhì)化莖段的木質(zhì)部表達(dá)，且經(jīng)激素和蔗糖處理后，這3個(gè)基因的表達(dá)變化趨勢(shì)完全一致，暗示可能構(gòu)成一種同工型。然而在拉彎處理實(shí)驗(yàn)中，雖然這3個(gè)基因在應(yīng)拉區(qū)木質(zhì)部中的表達(dá)皆明顯

8、大于對(duì)照樣品，但BlCesA4在對(duì)應(yīng)區(qū)木質(zhì)部中的表達(dá)變化與BlCesA1、BlCesA3不鼠。BlCesA2、8lCesA6和BlCesA7主要在葉片、韌皮部中表達(dá)，在功能上可能主要參與初生壁的形成。BlCesA8雖與BlCesA6具有較高序列相似度，但主要在幼葉、韌皮部和形成層表達(dá)，且在激素、蔗糖和拉彎處理下兩個(gè)基因的表達(dá)皆存在一定差異，該基因可能不只是在初生壁的形成中發(fā)揮作用。
　　 4.運(yùn)用基于RNA-Seq的數(shù)字表達(dá)譜技

9、術(shù)對(duì)應(yīng)拉木形成早期階段（拉彎處理6h到7d）的應(yīng)拉區(qū)木質(zhì)部（包括對(duì)照樣品）進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析，共檢測(cè)到44，680個(gè)Unigenes表達(dá)，其中符合篩選條件的差異表達(dá)Unigenes有4，567個(gè)，涉及至少1，151個(gè)代謝途徑。從GO分類(lèi)結(jié)果看，差異表達(dá)Unigenes至少包含40個(gè)亞類(lèi)，且光皮樺拉彎處理總體會(huì)導(dǎo)致相關(guān)代謝增強(qiáng)、酶活提高。進(jìn)一步對(duì)21個(gè)參與纖維素、木質(zhì)素合成相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析，共檢測(cè)到163個(gè)編碼這些酶的U

10、nigenes在該發(fā)育階段表達(dá)，其中109個(gè)發(fā)生了明顯的表達(dá)變化，且76個(gè)(69.7％)在次生木質(zhì)部特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)。纖維素合成途徑中主要酶編碼基因多數(shù)呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)，較好地印證了光皮樺應(yīng)拉木中纖維素含量增加及膠質(zhì)層存在的事實(shí)。以部分編碼CesA、 SUS和KOR的Unigenes為指導(dǎo)基因進(jìn)行基因共表達(dá)分析，發(fā)掘到3個(gè)可能參與光皮樺應(yīng)拉木形成的MYB和OVATE類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。在編碼參與苯丙烷途徑主要酶的基因序列中，有多個(gè)在次生木質(zhì)部?jī)?yōu)

11、勢(shì)表達(dá)的Unigenes卻呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá);而在木質(zhì)素單體特異途徑中，多數(shù)注釋為CCR、 CAD和SAD的Unigenes表現(xiàn)為明顯的下調(diào)表達(dá)，表明應(yīng)拉木中木質(zhì)素含量相對(duì)下降可能主要與木質(zhì)素單體途徑中的酶基因有關(guān)。此外，在該應(yīng)拉木形成早期階段，多數(shù)注釋為生長(zhǎng)素反應(yīng)因子和誘導(dǎo)蛋白的Unigenes呈現(xiàn)明顯的下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，而超過(guò)半數(shù)的外輸載體基因卻發(fā)生了顯著的上調(diào)表達(dá)。
　　 以上研究結(jié)果不僅為光皮樺木材形成分子遺傳基礎(chǔ)的進(jìn)一步解析奠定