研究生蛋白質(zhì)組學(xué)解答題集錦

1、<p>　　一、解釋（共15分）</p><p>　　1、MALDI TOF MS（10分）</p><p>　　基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization / Time of Flight Mass Spectra），離子源是基質(zhì)輔助激光解吸電離，質(zhì)量分析器是飛行時(shí)間管。MALDI-TOF MS是近

2、年來(lái)獲得快速發(fā)展的一種軟電離生物質(zhì)譜，它的建立突破了生物大分子質(zhì)譜分析的難題，該技術(shù)無(wú)論在理論上還是在設(shè)計(jì)上都具有簡(jiǎn)單、高效、靈敏、快速、準(zhǔn)確、測(cè)定質(zhì)量范圍大等特點(diǎn)。</p><p><b>　　基本原理：</b></p><p>　　MALDI是利用一定波長(zhǎng)的激光脈沖，在極短的時(shí)間間隔內(nèi)，對(duì)含被測(cè)樣品靶物的一個(gè)微小區(qū)域提供高能量，從固相直接獲得離子的電離方法，其基本

3、特點(diǎn)就是使用了固體基質(zhì)，特別適用于對(duì)熱敏感或不揮發(fā)化合物的離子化，因此在蛋白質(zhì)組分析中得到了廣泛應(yīng)用。</p><p>　　TOF分析器的離子分離是用非磁方式達(dá)到的，離子在離子源中形成后為電場(chǎng)所加速，進(jìn)入真空無(wú)場(chǎng)漂移區(qū)，具有不同質(zhì)荷比的離子因其通過(guò)漂移區(qū)的時(shí)間不同而實(shí)現(xiàn)分離，先后到達(dá)檢測(cè)器產(chǎn)生信號(hào)。質(zhì)量較輕的離子飛行速度快,較早到達(dá)檢測(cè)器；較重的離子飛行速度慢，較晚到達(dá)檢測(cè)器，且離子的飛行時(shí)間與其質(zhì)荷比的平方根(

4、 m / z )1/2 成正比，因此可以通過(guò)檢測(cè)飛行時(shí)間來(lái)測(cè)定離子的質(zhì)荷比。</p><p>　　2、免疫共沉淀（5分）</p><p>　　Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗體-抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。基本原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋

5、白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能被沉淀下來(lái)。該技術(shù)可用于鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合以及進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)分析，還可用來(lái)篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。</p><p>　　二、 問(wèn)答題（共85分）</p><p>　　1、Western Blotting 的流程（10分）。</p><p>　　答

6、1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation) 2. 電泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝膠配制 (2) 樣品處理(3) 上樣與電泳3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer) 4. 封閉(Blocking) 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)7. 蛋白檢測(cè)(De

7、tection of proteins)8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)</p><p>　　2、血漿/血清蛋白質(zhì)組研究中需要著重注意的問(wèn)題（10分）。</p><p>　　因血漿血清中的含有各種蛋白質(zhì)及降解產(chǎn)物，想要獲得所需蛋白，需選擇適合的前處理?xiàng)l件，尤其在進(jìn)行血漿的肽組學(xué)分析時(shí)顯得更為重要。</p><p>　　1、血漿/血清樣品選

8、擇</p><p>　?、偃パ“宓难獫{由于避免血小板的激活作用，減少了蛋白質(zhì)的體外降解，因而較血清更適合一定的肽組學(xué)研究；</p><p>　?、谌パ“宓腅DTA血漿或枸櫞酸血漿樣品，更適合分析低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)；</p><p>　?、廴绻褂靡欢ǖ牡鞍酌敢种苿?，一定要在早期加入，而且要謹(jǐn)慎使用，因?yàn)橐种苿┑募尤肟赡軐?duì)MS分析造成一定的干擾，而且一些小分子的

9、抑制劑與蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)的亞型，這些都將使得分析結(jié)果變得復(fù)雜。</p><p>　　2、樣品的收集與貯存</p><p>　?、贋闇p少血小板的污染，血液樣品在分析前最好用0.2μm的低蛋白質(zhì)結(jié)合膜過(guò)濾，樣品分裝冰凍儲(chǔ)存，減少融化-再冰凍的循環(huán)；</p><p>　　②樣品應(yīng)分裝并貯存在液氮中，減少或不加蛋白酶抑制劑，以減少對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。</p>

10、;<p>　　3、去除高豐度蛋白和分級(jí)技術(shù)</p><p>　　血漿/血清樣品中蛋白質(zhì)種類很多，而且所含蛋白質(zhì)具有較大的動(dòng)力學(xué)范圍，其中有許多豐度較高但不含有特殊生物學(xué)信息的蛋白質(zhì)，這將會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分析造成極大的困難，甚至根本不能檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)，因此，通過(guò)對(duì)原始蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫和分步分離減少樣品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，可以極大簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)和分析，提高對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和識(shí)別的靈敏度和準(zhǔn)確度。&l

11、t;/p><p><b>　　4、多維策略的運(yùn)用</b></p><p>　　3、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)定義及主要研究領(lǐng)域。試舉例說(shuō)明其在藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用（10分）。</p><p>　　藥物蛋白質(zhì)組學(xué)就是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。</p><p>　　藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究領(lǐng)域：1臨床前研究-發(fā)現(xiàn)所有可能的藥

12、物作用靶點(diǎn)，以及針對(duì)這些靶點(diǎn)的全部可能的化合物，以及應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機(jī)制和毒理學(xué)；2臨床研究方面-發(fā)現(xiàn)藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志物，或以蛋白質(zhì)譜的差異將患者分類并給予個(gè)體化治療。</p><p>　　藥物蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用舉例：</p><p>　?。?）研究人員通過(guò)比較給藥前后的蛋白質(zhì)組，找到了藥物阿霉素抗乳腺癌的一個(gè)作

13、用靶標(biāo)Hsp27。（2）瘧原蟲(chóng)入侵血紅細(xì)胞的阻斷靶點(diǎn)探測(cè)：半胱氨酸蛋白水解酶是瘧原蟲(chóng)生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化學(xué)探針I(yè)125-DCG-04打靶，然后通過(guò)抗DCG-04的生物素純化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶類的亞蛋白質(zhì)組；通過(guò)酶活性分析，最終發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲(chóng)的入侵血紅細(xì)胞的裂殖期，僅有一個(gè)有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì)—falcipain 1；從數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到falcipain 1的抑制劑YA29-Eps

14、，結(jié)果證實(shí)YA29-Eps可阻斷瘧原蟲(chóng)的入侵紅細(xì)胞。</p><p>　　4、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)與功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和內(nèi)容的差異，以及在臨床研究和應(yīng)用上的特點(diǎn)與作用（10分）。</p><p>　　5、蛋白質(zhì)組學(xué)在心血管基礎(chǔ)和臨床研究中的目的和意義（10分）。臨床將研究結(jié)果主要用于：①?gòu)牡鞍踪|(zhì)水平研究相關(guān)心血管疾病的發(fā)病機(jī)制；②應(yīng)用心血管疾病蛋白標(biāo)記物來(lái)更早、更準(zhǔn)確地檢測(cè)心血管疾病，

15、尤其是急性冠脈綜合征(ACS)；③蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)源的信息作 為目前患者診斷的補(bǔ)充；④蛋白質(zhì)組檢測(cè)獲得的信息有利于個(gè)體化治療，為其提供新的治療靶位；⑤蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)工具和信息用于治療的各個(gè)階段，可以適時(shí)評(píng)估治療的效果和校正治療方案。 </p><p>　　6、目前的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)和不足（10分）。</p><p>　　蛋白質(zhì)是機(jī)體生理、病理活動(dòng)功能的直接執(zhí)行者，對(duì)于它的

16、性質(zhì)和數(shù)量變化的精確把握是揭示機(jī)體生理變化和疾病病因、發(fā)病機(jī)制的重要切入點(diǎn)。與傳統(tǒng)的單一蛋白質(zhì)研究方法相比，組學(xué)技術(shù)可大大提高診斷的敏感性和特異性，蛋白質(zhì)組學(xué)的這一技術(shù)特點(diǎn)無(wú)疑在醫(yī)學(xué)研究中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，它可以跟蹤機(jī)體最細(xì)微的生理病理變化，通過(guò)對(duì)疾病特異性蛋白質(zhì)的尋找，使疾病的早期診斷成為可能。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為正常生理研究、疾病診斷，尤其是早期診斷方面提供了廣闊的技術(shù)平臺(tái)，在指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后等方面具有巨大發(fā)揮空間。</p&g

17、t;<p>　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在各個(gè)領(lǐng)域、各個(gè)方面，例如，神經(jīng)生理學(xué)方面，由于大腦高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，傳統(tǒng)研究方法已難以適應(yīng)亟待發(fā)展的科研及臨床需求，而蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)給神經(jīng)科學(xué)研究帶來(lái)新的動(dòng)力；腫瘤的早期診斷及預(yù)后判斷是目前蛋白質(zhì)</p><p>　　7、鼻咽癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究 的內(nèi)容和成果（10分）。</p><p>　　1)NPC不同階段和分化程度

18、的蛋白質(zhì)組學(xué)研究</p><p>　　腫瘤分化過(guò)程中蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究對(duì)于腫瘤診斷和治療具有十分重要意義。FFPE組織蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的成功建立為腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究開(kāi)拓了更廣闊的研究領(lǐng)域</p><p>　?。?）腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 </p><p>　　為闡明腫瘤微環(huán)境在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制，從間質(zhì)中尋找 NPC 診斷或治療的分子靶標(biāo)

19、，采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 對(duì)純化的鼻咽癌間質(zhì)和正常鼻咽間質(zhì)進(jìn)行了研究和比較。2D- DIGE（熒光雙向差異凝膠電泳）技術(shù)分離鑒定NPC間質(zhì)與正常鼻咽間質(zhì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)一步對(duì)差異蛋白Periostin的功能及作用機(jī)理進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn):&&Periostin 在NPC間質(zhì)高表達(dá)，&& 其通過(guò)與Integrin αVβ5結(jié)合，來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，表明腫瘤微環(huán)境的蛋白質(zhì)組變異在鼻咽癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用<

20、;/p><p>　　3）NPC放療抵抗的蛋白質(zhì)組學(xué)</p><p>　　部分 NPC 對(duì)放療抗拒，但其機(jī)制仍然不甚清楚，因此尋找鼻咽癌放療抗拒相關(guān)的蛋白質(zhì)，不僅有助于揭示鼻咽癌放療抗拒的機(jī)制，且能為鼻咽癌放療敏感性預(yù)測(cè)及鼻咽癌的個(gè)體放療提供科學(xué)依。2DE篩選放療抵抗（IR)的NPC細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)，研究結(jié)果提示：14-3-3σ和Maspin的下調(diào)及GRP78和Mn-SOD的上調(diào)與放療抵抗相關(guān)

21、，這四個(gè)蛋白質(zhì)有望作為預(yù)測(cè)鼻咽癌放療反應(yīng)的分子標(biāo)志物</p><p>　　4）重要蛋白質(zhì)和信號(hào)分子在NPC發(fā)生發(fā)展中的作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究P53、TNF-αRKIP： Raf 激酶抑制蛋白P53下調(diào)致HSP27和14-3-3σ上調(diào)，GRP75下調(diào),上調(diào)P53后， HSP27和14-3-3σ下調(diào)， GRP75上調(diào)。以上結(jié)果為揭示NPC細(xì)胞中p53蛋白聚集和功能異常的機(jī)制，以及p53基因在NPC發(fā)病中的作用提供了新線

22、索</p><p>　　通過(guò)多角度對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的探索和研究，發(fā)現(xiàn)了一批在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，為鼻咽癌發(fā)生機(jī)制和分子標(biāo)志物篩選提供了重要線索，部分蛋白有望成為腫瘤標(biāo)志物。</p><p>　　8、雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的優(yōu)缺點(diǎn)（8分）。我</p><p>　　雙向電泳是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分辨率最高、信息量最大的分離

23、技術(shù)。具體優(yōu)點(diǎn)如下：</p><p>　　1）. 可以將上千種不同的蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái) ，并得到每種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、表觀分子量和含量等信息。2）.如果雙向電泳后續(xù)接一系列自動(dòng)化操控，就能大大增加蛋白質(zhì)分析與鑒定的能力3）.可檢測(cè)翻譯后和翻譯過(guò)程的蛋白質(zhì)修飾</p><p>　　雖然雙向電泳是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最有效的分離技術(shù)，其</p><p>　　缺點(diǎn)：1）、不

24、能進(jìn)行可完全的2-DE分析</p><p>　　2）、許多較大的疏水蛋白質(zhì)在IEF分析中的結(jié)果不理想</p><p>　　3）、對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)大（）100000）的蛋白質(zhì)分離分析能力差 4、雙向電泳不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，不能適應(yīng)大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析的需要5、雙向電泳首先由的主要染色技術(shù)（考馬斯亮蘭染色、銀染色）的檢測(cè)領(lǐng)命度較差，且局限在越100倍的動(dòng)態(tài)范圍，而細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)力學(xué)范圍為百

25、萬(wàn)倍，而且從膠上切割下的蛋白點(diǎn)消化后所產(chǎn)生的肽的回收率常常低于60%，這更會(huì)妨礙MS對(duì)低豐度蛋白的鑒定。</p><p>　　9、亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵及其解決措施（7分）。</p><p>　　由于細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上與許多其他亞細(xì)胞組分相關(guān)聯(lián)，和細(xì)胞器組成的動(dòng)態(tài)性，所以分離得到的細(xì)胞器很難達(dá)到100% 的純度。所以，亞細(xì)胞組分的純度問(wèn)題和亞細(xì)胞組分生物學(xué)功能的深入挖掘是亞細(xì)胞蛋白質(zhì)

26、組研究所面臨的挑戰(zhàn)。現(xiàn)在已經(jīng)有一些研究策略來(lái)解決這一難點(diǎn)問(wèn)題，如Schirmer等提出的差減蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)解決核膜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)污染問(wèn)題；Andersen 等提出的蛋白質(zhì)校正譜圖分析法(protein correlation profiling，PCP)來(lái)分析可能定位于中心體的蛋白質(zhì)；Jiang 等運(yùn)用ICAT 技術(shù)和生物信息學(xué)手段的方法來(lái)確證線粒體蛋白質(zhì)，排除污染蛋白。一、解釋：</p><p>　　1、Two-

27、dimensional Gel Electrophoresis</p><p>　　2、MALDI TOF MS</p><p>　　3、蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的in silico生物學(xué)</p><p>　　4、亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)</p><p>　　二、簡(jiǎn)要說(shuō)明蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)或疾病研究中的應(yīng)用。</p><p>　　三

28、、通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)入http://www.hupo.org/ ，在閱讀Plasma Proteome Project中Overview of project的基礎(chǔ)上，介紹該項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容。</p><p>　　四、將文獻(xiàn)Proteome Analysis of Hepatocellular Carcinoma by Two-dimensional Difference Gel Electrophoresis（Fuch

29、u He et al，Molecular & Cellular Proteomics 6:1798-1808, 2007）中的ABSTRACT翻譯成中文。</p><p>　　五、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究領(lǐng)域有哪些？</p><p>　　六、蛋白質(zhì)組學(xué)在研究與應(yīng)用上有哪些局限性？</p><p>　　1、Two-dimensional Gel Electro

30、phoresis：即雙向凝膠電泳,它是當(dāng)前蛋白組學(xué)研究中分辨率最高，信息量最大的分離技術(shù)，它的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開(kāi)。</p><p>　　2、MALDI TOF MS：即基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，MALDI-TOFMS（Matrix Assisted Laser Desorption Io

31、nization Time of Flight Mass Spectrometry）；其原理是：當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即測(cè)定離子的質(zhì)量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比來(lái)檢測(cè)離子。 MALDI-TOF-MS的中心技術(shù)就是依據(jù)樣品的質(zhì)荷比（M/Z）的不

32、同來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)得樣品分子的分子量。它具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分辨率高、圖譜簡(jiǎn)明、質(zhì)量范圍廣及速度快等特點(diǎn)，在操作上制樣簡(jiǎn)便、可微量化、大規(guī)模、并行化和高度自動(dòng)化處理待檢生物樣品，而且在測(cè)定生物大分子和合成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜近年來(lái)已成為檢測(cè)和鑒定多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強(qiáng)有力工具，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域蛋白質(zhì)組</p><p>

33、;　　3、蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的in silico生物學(xué)：這是生物信息學(xué)的新名詞。相對(duì)于生命科學(xué)研究中經(jīng)常使用的in vivo（體內(nèi)）與in vitro（體外）這兩個(gè)名詞， In silico強(qiáng)調(diào)使用計(jì)算機(jī)來(lái)解決生物學(xué)問(wèn)題，In silico生物學(xué)是生物學(xué)與信息學(xué)的交叉學(xué)科。生物信息學(xué)已經(jīng)成為蛋白組學(xué)研究中必不可少的組成部分，其應(yīng)用包括：編碼的DNA序列的尋找與分析,蛋白質(zhì)序列信息的獲取,蛋白質(zhì)鑒定和性質(zhì)預(yù)測(cè),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè),蛋白質(zhì)序

34、列分析,數(shù)據(jù)的分析與整合 。</p><p>　　4、亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)：是利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)來(lái)分析一種組織或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成。細(xì)胞內(nèi)成分根據(jù)空間結(jié)構(gòu)、分布及功能的不同，分成不同的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)域，如細(xì)胞膜、胞漿，線粒體、溶酶體、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核和高爾基體等：另外，細(xì)胞器內(nèi)一些功能單位多是大分子結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)復(fù)合體，如核基質(zhì)、剪接體、紡錘體、核孔結(jié)構(gòu)及核糖體等，對(duì)這些亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以

35、更好地理解全細(xì)胞蛋白。</p><p>　　二、簡(jiǎn)要說(shuō)明蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)或疾病研究中的應(yīng)用。</p><p>　　答：蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病的研究中占有十分重要的地位，旨在運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段，通過(guò)比較正常和病理情況下細(xì)胞、組織或體液中蛋白質(zhì)在組成成分、表達(dá)水平、表達(dá)位置和修飾狀態(tài)上的差異，尋找疾病診斷和預(yù)后的特異性蛋白質(zhì)，包括特異性抗原及相關(guān)抗原、受體、酶等，以及藥物治療的靶標(biāo)等。通過(guò)

36、對(duì)疾病相關(guān)功能蛋白質(zhì)進(jìn)行定性、定量和表征研究，深入了解這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，揭示疾病過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的活動(dòng)規(guī)律，為疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的闡明和早期診斷及治療提供理論依據(jù)和解決途徑。</p><p>　　三、通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)入http://www.hupo.org/ ，在閱讀Plasma Proteome Project中Overview of project的基礎(chǔ)上，介紹該項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容。</p>

37、<p>　　答: 血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃（PPP）2003年到2005年的計(jì)劃是：制備人類血清和血漿的參考樣品，并將其分發(fā)到全球55個(gè)參與該計(jì)劃的實(shí)驗(yàn)室，以促進(jìn)新興技術(shù)的應(yīng)用，并為人類血清和血漿蛋白質(zhì)檢測(cè)和識(shí)別提供了大量的數(shù)據(jù)和綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。運(yùn)用混合蛋白質(zhì)去除法、分餾、質(zhì)譜分析和免疫分析方法建立的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)傳輸協(xié)議，通過(guò)搜索引擎和注釋組鏈接到基因和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。PPP創(chuàng)建了一個(gè)新的人類血漿蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，并已經(jīng)為將來(lái)在血漿和血清研究中的

38、應(yīng)用提出了一些建議。</p><p>　　PPP的合作試驗(yàn)室和工作組試驗(yàn)階段處理：(a)標(biāo)本穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)濃縮; (b)用18 MS/MS數(shù)據(jù)集（包括亞蛋白質(zhì)組分析）進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定; (c)用原始的MS/MS光譜進(jìn)行獨(dú)立分析; (d)搜索引擎性能; (e)生物注釋和見(jiàn)解 (f)抗體陣列; (g)直接質(zhì)譜分析/表面增強(qiáng)激光解吸電離分析。 MS/MS數(shù)據(jù)集已經(jīng)有15710種不同國(guó)際蛋白質(zhì)指數(shù)(IPI)的蛋白質(zhì)身份證，

39、PPP積分算法應(yīng)用多肽序列的多重匹配產(chǎn)生了9504個(gè)經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)肽段鑒別的IPI蛋白質(zhì)和3020個(gè)經(jīng)過(guò)兩個(gè)或多個(gè)肽段鑒別的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的特征已經(jīng)由Gene Ontology, InterPro, Novartis Atlas, Online Mendelian Inheritance in Man和基于免疫分析的濃度測(cè)定所描述。這些數(shù)據(jù)庫(kù)允許檢測(cè)許多其他子集，如1274個(gè)經(jīng)過(guò)三個(gè)或多個(gè)肽段鑒定的蛋白質(zhì)。用反向蛋白質(zhì)匹配DNA方法

40、鑒別了118個(gè)以前未知的開(kāi)放閱讀框。</p><p>　　來(lái)自合作計(jì)劃和實(shí)驗(yàn)室的具體配套計(jì)劃的發(fā)現(xiàn)于2005年8月刊登在蛋白質(zhì)組學(xué)研究特刊 “ 探索人類血漿蛋白質(zhì)組” ，它在慕尼黑舉行的HUPO第四次世界蛋白質(zhì)組學(xué)大會(huì)上向所有參會(huì)者發(fā)布。</p><p><b>　　PPP長(zhǎng)期目標(biāo)是：</b></p><p>　　綜合分析人類血漿和血清蛋白成分

41、</p><p>　　通過(guò)驗(yàn)證生物標(biāo)志物，識(shí)別隨著時(shí)間推移不同個(gè)體內(nèi)變異的生物學(xué)來(lái)源</p><p>　　生理：年齡，性別/月經(jīng)周期，運(yùn)動(dòng)</p><p>　　病理：選定的疾病/特殊人群</p><p><b>　　藥理：常見(jiàn)的藥物</b></p><p>　?。?）測(cè)定不同人群和人群內(nèi)的變異程度

42、</p><p>　　PPP的下一階段可能包括：(a)通過(guò)建立共識(shí)和新的研究建立規(guī)范化的操作步驟; (b)對(duì)來(lái)源于HUPO的機(jī)構(gòu)和其他已公布的研究的數(shù)據(jù)繼續(xù)的研究和分析; (c)簡(jiǎn)化并盡可能組織與重大疾病相關(guān)的候選生物標(biāo)志物的研究，以用于早期診斷，更好地對(duì)新近被診斷的患者進(jìn)行分級(jí)，基于途徑的靶向治療的檢測(cè)以及用于預(yù)防性干預(yù)措施的設(shè)計(jì)。最主要的挑戰(zhàn)是敏感性，分辨率，處理量的同時(shí)增加。</p><

43、p><b>　　與其他合作的倡議：</b></p><p>　?。?）該項(xiàng)目與人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HLPP）和人類腦蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HBPP）相互合作，以確保血漿和（或）血清的分析和組織標(biāo)本分析同步，就像先行者們建立的，可用于檢測(cè)感興趣的不同疾病階段的組織蛋白標(biāo)志物的方法。</p><p>　?。?）生物信息學(xué)，數(shù)據(jù)分析以及儲(chǔ)存問(wèn)題已由來(lái)自蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)H

44、ermjakob和Apweiler合作得以解決。</p><p>　?。?）與人類抗體計(jì)劃（HAI）的相互影合作仍在進(jìn)行，所以得到的任何抗體都可以添加到HAI數(shù)據(jù)庫(kù)中。</p><p>　　四、將文獻(xiàn)Proteome Analysis of Hepatocellular Carcinoma by Two-dimensional Difference Gel Electrophoresis（

45、Fuchu He et al，Molecular & Cellular Proteomics 6:1798-1808, 2007）中的ABSTRACT翻譯成中文。</p><p>　　答:肝細(xì)胞癌（HCC）是一種高度惡性腫瘤，并且慢性的HBV病毒感染是造成肝細(xì)胞癌的一個(gè)主要的危險(xiǎn)因素之一。為了明確在肝細(xì)胞癌中有致癌作用的蛋白質(zhì)，我們用二維熒光DICG去研究在該腫瘤以和臨近的沒(méi)有腫瘤的組織樣本中表達(dá)有差異的

46、蛋白質(zhì)。研究對(duì)象為12個(gè)HBV病毒感染所致的肝細(xì)胞癌癥患者，在腫瘤樣品中總共有61種蛋白質(zhì)有顯著地上調(diào)（比率≥2，P≤0.01），然而有158種蛋白質(zhì)降低（比率≥-2，P≤0.01）。在這些蛋白質(zhì)中有71種基因產(chǎn)物被確定。熱休克蛋白70和熱休克蛋白90家族的數(shù)量同時(shí)上調(diào)，然而在肝細(xì)胞癌癥患者中與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)卻降低了。在這些結(jié)果中線粒體和過(guò)氧化物酶體中蛋白質(zhì)的下降提示了在肝細(xì)胞癌致癌過(guò)程中一些特殊細(xì)胞器功能的喪失，肝臟甲基化循環(huán)中與代

47、謝相關(guān)的四種酶在肝細(xì)胞癌的組織中下降了，提示了S-腺苷甲硫氨酸在肝細(xì)胞癌癥患者中的缺失。2種基因產(chǎn)物即3-磷酸甘油酸脫氫酶和氯甲亞胺轉(zhuǎn)移酶-環(huán)化脫氨酶被確定呈反比變化，提示了這兩種蛋白質(zhì)的不同異構(gòu)體或翻譯后的不同修飾在肝細(xì)胞癌中都扮演了不同的角色。首次通過(guò)Western blot 證實(shí)在肝細(xì)胞癌中熱休克蛋白70和熱休克蛋白90組織蛋白</p><p>　　五、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究領(lǐng)域有哪些？</p>

48、;<p>　　答:藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想和策略正在滲透到藥物開(kāi)發(fā)與臨床應(yīng)用的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括臨床前研究中分子藥理篩選模型的構(gòu)建、小分子化合物的篩選和優(yōu)化、先導(dǎo)化合物的選擇、藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)、藥物作用機(jī)制的研究、藥物的毒性研究等；臨床研究中應(yīng)用藥物蛋白質(zhì)組學(xué)策略篩選用作疾病分類分型和臨床系統(tǒng)診斷標(biāo)志的疾病特異性蛋白、評(píng)價(jià)藥物療效預(yù)測(cè)疾病與后及開(kāi)展藥物個(gè)體化治療等。</p><p>　　六、蛋白質(zhì)組

49、學(xué)在研究與應(yīng)用上有哪些局限性？</p><p>　　答:1.蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)數(shù)量巨大，僅一個(gè)人體細(xì)胞在不同時(shí)段、不同水平表達(dá)的蛋白質(zhì)就有15000種之多，分子質(zhì)量多在50-100kDa的范圍，其等電點(diǎn)、疏水性、修飾狀況等差別很大。目前最好的分離方法也只能分離1500種左右的蛋白質(zhì)，因此還需建立分辨率更高的分離技術(shù)平臺(tái)。</p><p>　　2.蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)含量的動(dòng)力學(xué)范圍很寬，蛋白

50、質(zhì)組學(xué)的研究要求能同時(shí)分析各種各樣的蛋白質(zhì)，盡可能得到蛋白質(zhì)組的“全息信息”，另一方面，低表達(dá)蛋白往往是具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，因此，又需要排除巨量的高表達(dá)蛋白的干擾，把微量的蛋白質(zhì)從蛋白質(zhì)混合物中堅(jiān)定出來(lái)。目前還沒(méi)有一種生物化學(xué)分析技術(shù)能完全滿足這樣的分析要求。</p><p>　　3.蛋白質(zhì)學(xué)尤其是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)檢測(cè)靈敏度也提出了很高的要求，現(xiàn)行的生物化學(xué)方法檢測(cè)靈敏度只在10-14mol/l左右，而生

51、物樣品，如血漿，對(duì)其中大部分蛋白質(zhì)成分的檢出則要比它高出3-8個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)拷貝數(shù)為10-102的低表達(dá)蛋白的分析，要求方法學(xué)的檢測(cè)靈敏度達(dá)到10-27mol/l甚至更高。</p><p>　　4.對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)非常重要的內(nèi)容，但目前人們采用的生物化學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、基于質(zhì)譜的方法以及遺傳學(xué)等多種方法，由于方法本身的限制性和分析條件的特異性，往往會(huì)造成假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。<

52、;/p><p>　　5.臨床樣本的處理往往是臨床蛋白質(zhì)組分析的瓶頸環(huán)節(jié)。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本主要是新鮮的活組織檢查標(biāo)本、血液與體液，這些材料難以像實(shí)驗(yàn)室研究材料那樣嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，所以在臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本的選擇、收集、儲(chǔ)存與技術(shù)處理方式等諸多過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果又很大的影響，必須進(jìn)行精心設(shè)計(jì)盡可能減少由于干擾因素帶來(lái)的蛋白質(zhì)。僅僅通過(guò)一、兩種技術(shù)顯然不可能完成對(duì)蛋白質(zhì)組內(nèi)成千上萬(wàn)種不同性質(zhì)的蛋白的分

53、離和檢測(cè)，沒(méi)有任何一種技術(shù)能滿足從表達(dá)到功能的所有類型的蛋白質(zhì)研究的需要，尤其在與疾病有關(guān)的情況下，故新的生物分析化學(xué)方法的研究與實(shí)踐在這當(dāng)中有重要地位。</p><p>　　總之，目前蛋白質(zhì)組學(xué)是由技術(shù)啟動(dòng)，但又是受技術(shù)制約的探索性科學(xué)。</p><p>　　一、根據(jù)免疫共沉淀和pull down技術(shù)的原理分析其用途和優(yōu)缺點(diǎn)（8分）。 </p><p>　　二、簡(jiǎn)

54、述藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的定義及主要研究領(lǐng)域。試舉例說(shuō)明其在藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用（8分）。</p><p>　　三、簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的樣品制備技術(shù)及2-DE技術(shù)的特點(diǎn)（10分）。</p><p>　　四、如何鑒定亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的樣品純度？（8分）</p><p>　　五、為什么不能單從mRNA水平來(lái)探討蛋白質(zhì)的表達(dá)以及為什么需要以組學(xué)的研究方式來(lái)研究

55、蛋白質(zhì)？(10分)</p><p>　　六、試述蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展趨勢(shì)和所面臨的挑戰(zhàn)（8分）。</p><p>　　七、試簡(jiǎn)述Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)的一般流程(10分)</p><p>　　八、闡述血漿/血清蛋白組學(xué)研究中需要著重注意的問(wèn)題（10分）。 </p><p>　　九、簡(jiǎn)述質(zhì)譜儀的組成要件和以MALDI TOF

56、 MS獲得PMF的分析流程（10分）。</p><p>　　十、簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)組學(xué)在心血管疾病中的應(yīng)用（8分）</p><p>　　根據(jù)免疫共沉淀和pull down技術(shù)的原理分析其用途和優(yōu)缺點(diǎn)</p><p>　　原理應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)</p><p>　　免疫共沉淀在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合，若細(xì)胞中有正

57、與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—SPA\Pansobin復(fù)合物，因?yàn)镾PA\Pansobin比較大，這樣復(fù)合物在離心時(shí)就被分離出來(lái)。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物四組分又被分開(kāi)。然后經(jīng)Western blotting法，用抗體檢測(cè)目的蛋白是什么，是否為預(yù)測(cè)蛋白。1確定生理?xiàng)l件下目的蛋白在細(xì)胞或組織內(nèi)是否存在與其相互作用的蛋白質(zhì)</p><p>　　2用于驗(yàn)證兩個(gè)已知相互

58、作用的蛋白質(zhì)1可以真實(shí)反映正常生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)間的相互作用。</p><p>　　2有過(guò)量表達(dá)引起的假陽(yáng)性可以排除。1需制備出一定量的多克隆或單克隆抗體，過(guò)程比較復(fù)雜。</p><p>　　2應(yīng)用范圍有較大局限</p><p>　　3可能檢測(cè)不到細(xì)胞中處于動(dòng)態(tài)平衡中的低親和與瞬間的相互作用</p><p>　　4僅應(yīng)用于從細(xì)胞中溶解出來(lái)后

59、仍存在于生理復(fù)合體中的蛋白質(zhì)。</p><p>　　Pull-down將誘餌蛋白質(zhì)和GST標(biāo)簽融合表達(dá)，一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行孵育，利用谷胱甘肽-Sepharose將GST-融合蛋白-目的蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后進(jìn)行聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。1鑒定能與已知融合蛋白質(zhì)相互作用的未知蛋白質(zhì)；</p><p>　　2鑒定兩個(gè)已知蛋白

60、質(zhì)之間是否存在相互作用。1簡(jiǎn)便，避免了使用同位素等危險(xiǎn)物質(zhì)</p><p>　　2融合蛋白親具有高通量性、高選擇性的特點(diǎn)</p><p>　　3、能夠研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中的相互作用。成功運(yùn)用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質(zhì)活性的重組融合蛋白，以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白的干擾</p><p>　　簡(jiǎn)述藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的定義及主要研究領(lǐng)域。試舉例說(shuō)明其在藥物

61、靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用</p><p>　　將蛋白組學(xué)的概念用于藥物研究領(lǐng)域，通過(guò)對(duì)比健康狀態(tài)與疾病狀態(tài)的細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，用于藥物研究或藥物受體的研究或藥物治療前后蛋白質(zhì)表達(dá)狀況的總體，以評(píng)價(jià)藥物類似物的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系，尋找高活性的藥物，由此發(fā)展起來(lái)的一門(mén)學(xué)科稱之為藥物蛋白組學(xué)。</p><p>　　藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究領(lǐng)域：臨床前研究-發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點(diǎn)，以及

62、針對(duì)這些靶點(diǎn)的全部可能的化合物，以及應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機(jī)制和毒理學(xué)；臨床研究方面-發(fā)現(xiàn)藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志物，或以蛋白質(zhì)譜的差異將患者分類并給予個(gè)體化治療。</p><p>　　藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)：闡明藥物的作用機(jī)制；藥物毒理作用機(jī)制。耐藥性及個(gè)體化治療的研究；中藥現(xiàn)代化中的研究應(yīng)用 </p><p>　　藥物蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物靶點(diǎn)發(fā)

63、現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用舉例：</p><p>　?。?）研究人員通過(guò)比較給藥前后的蛋白質(zhì)組，找到了藥物阿霉素抗乳腺癌的一個(gè)作用 靶標(biāo)Hsp27。 （2）瘧原蟲(chóng)入侵血紅細(xì)胞的阻斷靶點(diǎn)探測(cè)：半胱氨酸蛋白水解酶是瘧原蟲(chóng)生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化學(xué)探針I(yè)125-DCG-04打靶，然后通過(guò)抗DCG-04的生物素純化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶類的亞蛋白質(zhì)組；通過(guò)酶活性分析，最終發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲(chóng)的

64、入侵血紅細(xì)胞的裂殖期，僅有一個(gè)有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì)—falcipain 1；從數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到falcipain 1的抑制劑YA29-Eps，結(jié)果證實(shí)YA29-Eps可阻斷瘧原蟲(chóng)的入侵紅細(xì)胞</p><p>　　簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的樣品制備技術(shù)及2-DE技術(shù)的特點(diǎn)3</p><p><b>　　技術(shù)名稱特點(diǎn)</b></p><p&g

65、t;　　激光捕獲顯微切割技術(shù)1、從任何組織中快速、精確地分離出純的特異細(xì)胞及細(xì)胞群?？梢苑蛛x收集到核仁、包涵體及染色體特異區(qū)帶等細(xì)微的對(duì)象。</p><p>　　2、在組織細(xì)胞或染色體的原位取材，所取材料的定位清楚，所研究對(duì)象的歷史背景明確。</p><p>　　3、保證所取材料一定層次上的同質(zhì)性。FCM也是一種強(qiáng)有力的同質(zhì)細(xì)胞分離技術(shù)，但是只能處理懸浮液中的細(xì)胞；而且，F(xiàn)CM需要各種特

66、</p><p>　　殊的標(biāo)志物才能完成分離。</p><p>　　4、適用于蘇木素伊紅染色（hematoxylin eosinstain,H&E stain）、免疫組化、熒光標(biāo)記等多種染色方式，可以與多種分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病理學(xué)技術(shù)結(jié)合使用。</p><p>　　高豐度蛋白去除技術(shù)蛋白質(zhì)組分組分離系統(tǒng)包括1蛋白質(zhì)組分離試劑盒；2蛋白質(zhì)組分離試劑盒&l

67、t;/p><p>　　ProteoExtract?Albumin/IgG</p><p>　　Removal Kit高豐度蛋白去除試劑盒快速。只需20-30分鐘；</p><p>　　簡(jiǎn)單。純化柱式的操作方法，可平行處理多個(gè)樣品；</p><p>　　高效去除白蛋白和IgG，利于檢測(cè)低豐度蛋白；</p><p>　　高特

68、異性、非特異性結(jié)合很少或沒(méi)有；</p><p>　　樣品高度富集，適于2DGE，LC等。</p><p>　　Aurum Serum高豐度蛋白去除試劑盒可以一次性地去除血清或血漿樣品中的白蛋白與IgG</p><p>　　Multiple Affinity Removal Column安捷倫公司的多重親和去除系統(tǒng)- LC 色譜柱是由單獨(dú)的LC 色譜柱和優(yōu)化的緩沖

69、液組成的，用來(lái)去除人血清中高達(dá)98-99%的六種干擾分析的高豐度蛋白質(zhì)（白蛋白、IgG、IgA、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白和抗胰蛋白酶）或鼠血清樣品中的三種蛋白質(zhì)（白蛋白、</p><p><b>　　IgG和轉(zhuǎn)鐵蛋白）</b></p><p>　　ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit去除占總蛋白質(zhì)量數(shù)97%－98%的20種蛋白質(zhì)

70、，平均清除率達(dá)99.6%。去除這20種蛋白質(zhì)后，血漿中的低豐度蛋白濃度可提高30～50倍</p><p>　　自由流電泳技術(shù)1、是基于液體的樣品分離/制備技術(shù)，與所有下游分離技術(shù)兼容；</p><p><b>　　2、分離非?？?；</b></p><p>　　3、液相分離保證初始樣品具有很高的回收率；</p><p>

71、　　4、采用連續(xù)模式，上樣和分離連續(xù)同時(shí)進(jìn)行；</p><p><b>　　5、分析對(duì)象廣泛；</b></p><p>　　6、分離條件溫和，適合活性生物材料的分離純化。</p><p>　　2-DE技術(shù)ISO-DALT系統(tǒng)</p><p><b>　　P32</b></p><

72、;p>　　IPG-DALT系統(tǒng)P32</p><p>　　非平衡Ph梯度電泳P32</p><p>　　圖譜所傳達(dá)信息P33右下第一段</p><p>　　4如何鑒定亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的樣品純度？</p><p>　　一、一般從三個(gè)方面對(duì)亞細(xì)胞器的純度進(jìn)行評(píng)價(jià)： 電子顯微鏡檢測(cè)； 標(biāo)志酶活性測(cè)定； Western blotWe

73、stern blot</p><p>　　二、質(zhì)膜的純度鑒定方法</p><p>　　1、形態(tài)學(xué)方法（常規(guī)透射電鏡、免疫電鏡觀察其切片，純細(xì)胞膜成空的膜泡或片狀結(jié)構(gòu)）</p><p>　　2、免疫印跡法（常用抗體caveolincaveolin、NaNa++--KK++--ATPaseATPase、flotillinflotillin、5`--nucleotidas

74、enucleotidase等）</p><p>　　3酶活測(cè)定法（測(cè) APAP、AAPP、NaNa++--KK++--ATPaseATPase、55``--nucleotidasenucleotidase的活性）</p><p>　　4、膜組分分析法（分析脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的比例） </p><p>　　三、微區(qū)結(jié)構(gòu)的檢驗(yàn)法 </p><p>　　

75、1、電鏡法（微區(qū)成直徑70nm70nm左右的空膜泡結(jié)構(gòu)</p><p>　　2、免疫印跡法（抗caveolincaveolin等）</p><p><b>　　3、膜組分分析法</b></p><p>　　為什么不能單從mRNA水平來(lái)探討蛋白質(zhì)的表達(dá)以及為什么需要以組學(xué)的研究方式來(lái)研究蛋白質(zhì)？</p><p>　　一、為

76、什么不能單從mRNA水平來(lái)探討蛋白質(zhì)的表達(dá)</p><p>　　（1）一個(gè)基因組對(duì)應(yīng)著多個(gè)蛋白質(zhì)組（動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)組）</p><p>　?。?） premRNA通過(guò)可變剪接生成不同的成熟mRNA </p><p>　?。?） mRNA表達(dá)：a與相應(yīng)的蛋白表達(dá)存在時(shí)間上的差異</p><p>　　b與相應(yīng)蛋白執(zhí)行功能的部位有所不同</p&

77、gt;<p>　?。?）不同mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率不同，有的甚至不翻譯</p><p>　　（5）基因和mRNA也不能反映： a不同蛋白質(zhì)間穩(wěn)定性的差異（結(jié)構(gòu)蛋白、信號(hào)分子）; b不同蛋白質(zhì)間修飾方式和程度的不同，而修飾（如磷酸化和糖基化）明顯影響蛋白質(zhì)的活性及功能; c蛋白質(zhì)之間的相互作用 ;</p><p>　　二、為什么需要以組學(xué)的研究方式來(lái)研究蛋白質(zhì)？</p

78、><p><b>　　見(jiàn)書(shū)P2</b></p><p>　　試述蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展趨勢(shì)和所面臨的挑戰(zhàn)</p><p>　　A隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展及其在多個(gè)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，其研究的發(fā)展重點(diǎn)也逐漸發(fā)生了轉(zhuǎn)變：</p><p>　　1）從全蛋白質(zhì)組向鎖定特定目標(biāo)物的蛋白質(zhì)組研究轉(zhuǎn)變</p><p>

79、　　(如亞細(xì)胞/功能蛋白質(zhì)組學(xué)） </p><p>　　2）從定性描述向定量分析轉(zhuǎn)變</p><p>　　3）由蛋白組研究向修飾蛋白組研究轉(zhuǎn)變</p><p>　　4）由體外研究向體內(nèi)研究轉(zhuǎn)變</p><p>　　5）從實(shí)驗(yàn)室研究向臨床應(yīng)用拓展</p><p>　　6）數(shù)據(jù)產(chǎn)出由數(shù)量向質(zhì)量轉(zhuǎn)變</p>&

80、lt;p>　　7）由簡(jiǎn)單積累向有效整合以及知識(shí)挖掘轉(zhuǎn)變</p><p>　　8）發(fā)展新方法，同時(shí)，整合并存的各種方法，實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)</p><p>　　9）蛋白質(zhì)組學(xué)與其它學(xué)科的交叉也將日益顯著和重要，這種交叉是新技術(shù)新方法的活水之源</p><p>　　B較基因組學(xué)更為復(fù)雜和困難</p><p>　　?蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過(guò)基因數(shù)目<

81、/p><p>　　?蛋白質(zhì)表達(dá)（種類和量）隨時(shí)、空而變</p><p>　　?每一蛋白質(zhì)并非只有一種分子實(shí)體（via PTM）</p><p>　　?沒(méi)有PCR等價(jià)物，難以對(duì)低豐度蛋白/多肽進(jìn)行分析和比較</p><p>　　?氨基酸之間沒(méi)有堿基之間的專一性互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系</p><p>　　?經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)

82、還需要傳統(tǒng)的方法來(lái)驗(yàn)證</p><p>　　因此，當(dāng)前的主要任務(wù):發(fā)展高通量、高靈敏度和高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)</p><p><b>　　C蛋白質(zhì)定量的難點(diǎn)</b></p><p>　　低豐度蛋白質(zhì)難于檢測(cè)，不可忽略 ,因?yàn)?lt;/p><p>　　a其種類遠(yuǎn)多于高豐度蛋白質(zhì)</p><p>　　b

83、往往與生物體功能的關(guān)系更密切</p><p>　　蛋白質(zhì)表達(dá)量差異很小：差異在50%以下時(shí)，精確定量成為瓶頸 </p><p>　　蛋白質(zhì)表達(dá)的瞬時(shí)性 </p><p><b>　　解決辦法：</b></p><p>　　?提高生物質(zhì)譜分析能力</p><p>　　?減少樣品制備過(guò)程中蛋白質(zhì)

84、的損失</p><p>　　?同時(shí)，要發(fā)展富集技術(shù)（對(duì)低豐度蛋白） </p><p>　　試簡(jiǎn)述Western Blotting 實(shí)驗(yàn)技術(shù)的一般流程</p><p>　　一、蛋白質(zhì)樣品制備：1.水溶液提取法2.低溫有機(jī)溶劑提取法3.水溶性多聚物沉淀法4. 通過(guò)層析或電洗脫法、色譜等制備目的蛋白</p><p>　　二、蛋白樣品的定量：1紫外

85、吸收法 2Bradford法 3其他商品化的試劑盒也可測(cè)蛋白 含量4凱氏定氮法 5福林-酚法</p><p><b>　　三、轉(zhuǎn)膜</b></p><p><b>　　1轉(zhuǎn)膜方法</b></p><p>　　半干法：用緩沖液濕潤(rùn)濾紙3張、膜、凝膠、緩沖液濕潤(rùn)濾紙3張順序放置，電轉(zhuǎn)10－30min。但高分子量的蛋白轉(zhuǎn)移效率

86、較低。</p><p>　　濕法：將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過(guò)夜。</p><p><b>　　2轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)</b></p><p>　　麗春紅S染色：蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次，脫色。</p><p>　　印度墨汁染色：只用于放射性標(biāo)記抗體或

87、放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過(guò)程。</p><p><b>　　四、封閉</b></p><p>　　目的：防止抗體與膜的非特異性結(jié)合</p><p>　　封閉液：脫脂奶粉（5％）、BSA、Western Blot 膜封閉液</p><p>　　五、一抗雜交：把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾

88、膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時(shí)，4 ℃過(guò)夜。洗去未結(jié)合的一抗：回收一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。 </p><p>　　六、二抗雜交：加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)， 37℃一小時(shí)，4 ℃過(guò)夜。洗去未結(jié)合的二抗：倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。 </p><p><b>　　七、底物顯色&l

89、t;/b></p><p>　　方法：辣根過(guò)氧化物酶法（HRP） 堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)</p><p>　　闡述血漿/血清蛋白組學(xué)研究中需要著重注意的問(wèn)題</p><p>　　1、血漿/血清樣品選擇 ①去血小板的血漿由于避免血小板的激活作用，減少了蛋白質(zhì)的體外降解，因而較血清更適合一定的肽組學(xué)研究； ②去血小板的EDTA血漿或枸櫞酸血漿

90、樣品，更適合分析低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)； ③如果要使用一定的蛋白酶抑制劑，一定要在早期加入，而且要謹(jǐn)慎使用，因?yàn)橐种苿┑募尤肟赡軐?duì)MS分析造成一定的干擾，而且一些小分子的抑制劑與蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)的亞型，這些都將使得分析結(jié)果變得復(fù)雜。 </p><p>　　2、樣品的收集與貯存 ①為減少血小板的污染，血液樣品在分析前最好用0.2μm的低蛋白質(zhì)結(jié)合膜過(guò)濾，樣品分裝冰凍儲(chǔ)存，減少融化-再冰凍的循環(huán)； ②樣品應(yīng)分裝并貯

91、存在液氮中，減少或不加蛋白酶抑制劑，以減少對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。 </p><p>　　3、去除高豐度蛋白和分級(jí)技術(shù) 血漿/血清樣品中蛋白質(zhì)種類很多，而且所含蛋白質(zhì)具有較大的動(dòng)力學(xué)范圍，其中有許多豐度較高但不含有特殊生物學(xué)信息的蛋白質(zhì)，這將會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分析造成極大的困難，甚至根本不能檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)，因此，通過(guò)對(duì)原始蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫和分步分離減少樣品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，可以極大簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)和分析，提高對(duì)低豐度蛋白

92、質(zhì)的檢測(cè)和識(shí)別的靈敏度和準(zhǔn)確度。 </p><p><b>　　4、多維策略的運(yùn)用</b></p><p>　　簡(jiǎn)述質(zhì)譜儀的組成要件和以MALDI TOF MS獲得PMF的分析流程</p><p>　　質(zhì)譜儀的組成：p43自己找重要的寫(xiě)</p><p>　　MALDI-TOF-MS分析流程：P45圖，感覺(jué)不全，但找不到了

93、</p><p>　　簡(jiǎn)述蛋白質(zhì)組學(xué)在心血管疾病中的應(yīng)用</p><p>　　臨床將研究結(jié)果主要用于：</p><p>　?、?gòu)牡鞍踪|(zhì)水平研究相關(guān)心血管疾病的發(fā)病機(jī)制；</p><p>　?、趹?yīng)用心血管疾病蛋白標(biāo)記物來(lái)更早、更準(zhǔn)確地檢測(cè)心血管疾病，尤其是急性冠脈綜合征(ACS)；</p><p>　?、鄣鞍踪|(zhì)組學(xué)來(lái)源的

94、信息作為目前患者診斷的補(bǔ)充；</p><p>　?、艿鞍踪|(zhì)組檢測(cè)獲得的信息有利于個(gè)體化治療，為其提供新的治療靶位；</p><p>　?、莸鞍踪|(zhì)組學(xué)檢測(cè)工具和信息用于治療的各個(gè)階段，可以適時(shí)評(píng)估治療的效果和校正治療方案。 </p><p><b>　　翻譯</b></p><p>　　為了綜合地研究肝細(xì)胞癌(HCC)患者

95、的自身抗體,我們運(yùn)用了一個(gè)基于血清學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的方法。</p><p>　　通過(guò)二維凝膠電泳(2 de)，將從HepG2.2.15細(xì)胞和HepG2細(xì)胞提取的全部蛋白分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟化物(PVDF)膜上,隨后用肝細(xì)胞癌患者的血清或正常對(duì)照組血清對(duì)其培養(yǎng)。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,13 hcc相關(guān)抗原可以被識(shí)別。使用Western blotting (WB)重組蛋白和蛋白質(zhì)

96、微陣列技術(shù)也進(jìn)一步證實(shí)了8號(hào)蛋白質(zhì)的抗原性。在慢性肝炎對(duì)照組，抗原微陣列的分析結(jié)果顯示出很強(qiáng)的角蛋白8和核纖層蛋白A / C的信號(hào);這表明針對(duì)角質(zhì)8和核纖層蛋白A / C的自體抗體可能并非hcc所特有。在隨后的分析中，這兩個(gè)抗原即被移除。在和正常的人對(duì)比中，DEAD((Asp-Glu-Ala-Asp)多肽3號(hào)盒,真核翻譯延長(zhǎng)因子2(eEF2),細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、異構(gòu)核核糖核蛋白A2(hnRNP A2)、前列腺結(jié)合蛋白,和tri

97、osephosphate異構(gòu)酶(TIM)的陽(yáng)性反應(yīng)頻率均明顯高于慢性肝炎肝細(xì)胞肝癌患者。肝細(xì)胞癌患者的DEAD多肽3號(hào)盒,eEF2,AIF和前列腺結(jié)合蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)頻率比其他任何癌癥患者更加頻繁。任何單個(gè)抗原的靈敏度在肝細(xì)胞癌I階段范圍可以從50%到85%。但這六個(gè)抗原結(jié)合后,其分析的靈敏度提高到90%。因此，我們得出結(jié)論:對(duì)這六個(gè)抗原的自體抗體檢測(cè)可能對(duì)肝癌的早期診斷有重要價(jià)值。</p><p>　　J. Pr