棉花中一個(gè)編碼P-type ATPase基因的功能分析.pdf

1、棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，但隨著全球氣候的異常，低溫，干旱等逆境條件嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量與品質(zhì)，轉(zhuǎn)基因抗性育種已成為解決這一問題的重要途徑之一。P-typeATPases是廣泛分布于生命體中的一種重要酶類，與植物生長(zhǎng)發(fā)育及抵抗逆境脅迫密切相關(guān)，但目前，有關(guān)棉花P-typeATPases卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室在Hai7124中克隆了一個(gè)編碼P-typeATPases的基因，命名Gbpatp。序列分析表明，該基因可能與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫相

2、關(guān)。為了闡明Gbpatp基因功能，本文對(duì)沉默Gbpatp同源基因的陸地棉和Gbpatp過量表達(dá)煙草進(jìn)行低溫和干旱脅迫處理，結(jié)果如下:
　　1.Gbpatp基因響應(yīng)低溫誘導(dǎo)。將Hai7124在2℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，模擬低溫脅迫，qRT-PCR分析Gbpatp基因響應(yīng)低溫誘導(dǎo)后的表達(dá)量。低溫處理2h、4h、8h、12h、24h后Gbpatp基因相對(duì)表達(dá)量分別為:3.3261、2.2078、1.4433、1.1412和1.2612，顯著

3、高于低溫處理前的相對(duì)表達(dá)量(1)，初步認(rèn)為Gbpatp基因響應(yīng)低溫上調(diào)表達(dá)。
　　2.Gbpatp基因與植物耐低溫能力相關(guān)。利用VIGS技術(shù)沉默陸地棉魯21中和Gbpatp同源的基因后，將VIGS棉花和非沉默棉花（對(duì)照）置于2℃光照培養(yǎng)箱，模擬低溫脅迫。48h后，VIGS棉花有3片葉子出現(xiàn)萎蔫，而對(duì)照無明顯萎蔫。丙二醛(MDA)是質(zhì)膜過氧化的產(chǎn)物之一，其含量間接反映植物抗逆境能力，MDA含量與植物抵抗逆境的能力呈負(fù)相關(guān);過氧化氫酶

4、(CAT)也是反映植物抵抗逆境脅迫能力的重要指標(biāo)之一，CAT活力與植物抵抗逆境的能力呈正相關(guān)。進(jìn)一步測(cè)定上述兩指標(biāo)，低溫處理前，VIGS棉花與對(duì)照MDA含量分別為:4.7024nmol/g和4.7529nmol/g，處理后，VIGS棉花和非沉默棉花MDA含量分別上升至36.9212nmol/g和21.7031nmol/g，VIG棉花MDA含量顯著高于對(duì)照;處理前，VIGS棉花和對(duì)照的CAT活力均在180U/(g·min)左右，無顯著差異

5、;處理后，VIGS棉花和對(duì)照CAT活力分別為95.2012U/(g·min)和135.0571U/(g·min)，VIGS棉花的CAT活力顯著低于對(duì)照。
　　以處理VIGS棉花同樣的方法處理Gbpatp過量表達(dá)T2代煙草。低溫處理48h后，轉(zhuǎn)基因煙草僅有最下部2片葉子出現(xiàn)萎蔫，對(duì)照則全部萎蔫;低溫處理前，轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照MDA含量均在2nmol/g左右，無顯著差異。48h后，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照MDA含量分別上升為17.66162

6、nmol/g、18.18292nmol/g和26.37982nmol/g，轉(zhuǎn)基因MDA含量顯著低于對(duì)照。低溫處理前，轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照的CAT活力均在65U/(g·min)左右，無顯著差異。低溫脅迫使2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照的CAT活力分別降低至:45.3927、43.7821U/(g·min)和15.731U/(g·min)，轉(zhuǎn)基因植株的CAT活力顯著高于對(duì)照。綜合以上的結(jié)果表明，Gbpatp基因與植物耐低溫能力相關(guān)。
　　3.Gbp

7、atp基因與植物耐干旱能力相關(guān)。利用濃度為5％、10％、15％和20％的PEG模擬干旱，研究T2代轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)指標(biāo)（發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽均日）和煙苗生長(zhǎng)指標(biāo)（下胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)、煙苗活力指數(shù)、株高脅迫指數(shù)）。PEG濃度為20％時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽均日分別為:40％，48％，3.01and11.67d，對(duì)照分別為:12％，16％，1.75and13d;此外，轉(zhuǎn)基因植株的下胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)、煙苗活力指數(shù)和

8、株高脅迫指數(shù)分別為:1.4cm，10.2cm，34.14和66，對(duì)照相應(yīng)數(shù)值為:1cm，4.6cm，9.80和33，以上數(shù)據(jù)表明，在PEG濃度為20％時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱能力。在其它模擬干旱脅迫條件下，得到與上述相同的結(jié)果。
　　4.Gbpatp基因促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。相同栽培條件下，觀察3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系4-6片真葉期的幼苗生長(zhǎng)情況，每個(gè)株系取20株苗，測(cè)量株高和根長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的株高和根長(zhǎng)在表型上明顯長(zhǎng)于對(duì)照。轉(zhuǎn)基因株系