東方蜜蜂抗螨相關(guān)基因的篩選及初步驗(yàn)證.pdf

1、狄斯瓦螨(Varroa destructor)是對(duì)蜜蜂威脅最大的病蟲害，幾乎對(duì)全世界范圍內(nèi)的養(yǎng)蜂業(yè)都造成了巨大的損失。本研究基于課題組前期研究所獲得的寶貴的蜂螨敏感型群體，采用Illumina Solexa測(cè)序技術(shù)及iTRAQ技術(shù)初步篩選出蜂螨抗性相關(guān)的候選基因，通過熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證候選差異基因，并對(duì)相關(guān)基因編碼區(qū)序列測(cè)定分析。本研究為進(jìn)一步研究蜜蜂抗螨分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)篩選出來的差異基因可為蜜蜂抗螨育種研究提供基因資源。主要

2、研究結(jié)果如下:
　　1.本研究選擇狄斯瓦螨感染的西方蜜蜂巢脾對(duì)抗性群體及敏感性東方蜜蜂群體進(jìn)行脅迫，采用以下措施降低各群體間的遺傳背景:a）受蜂螨脅迫的抗性群體(C+)和受脅迫的敏感性群體(M+)所接受的西方蜜蜂巢脾受狄斯瓦螨蜂螨感染程度相當(dāng)且具有數(shù)量相當(dāng)?shù)墓し浜托鄯涞姆馍w蜂房;抗性對(duì)照組(C)及敏感性對(duì)照組(M)使用未受瓦螨感染的西方蜜蜂巢脾。b）采用10對(duì)微衛(wèi)星引物選擇全同胞姐妹用于下一步實(shí)驗(yàn)。c）對(duì)蜂群受瓦螨脅迫的情況進(jìn)行連

3、續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)敏感性群體抗螨能力較差，而抗性群體則在遭到蜂螨脅迫后24h時(shí)抗螨行為達(dá)到高峰，因此確定脅迫24h后進(jìn)行樣本采集。
　　2.采用Illumina Solexa轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)蜂螨脅迫及未遭蜂螨脅迫的敏感性和抗性東方蜜蜂群體進(jìn)行哺育蜂頭部轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從頭組裝獲得了91，172個(gè)unigenes，對(duì)這些unigenes進(jìn)行功能注釋。COG分類中，共有23，790條unigene歸類到25類基因功能。GO分類注釋了85，577

4、條unigene的生物學(xué)途徑，其中參與細(xì)胞生理過程(14，797)和代謝過程(10，17)的最多;注釋了48，194條unigene的細(xì)胞學(xué)組件，其中細(xì)胞及細(xì)胞組分最多，都為10，323條;描述了29，301條unigene的分子功能，其中結(jié)合功能(11，370)和催化活性(11，042)的最多。39，625條在KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋到257條通路，定位到代謝通路的unigene數(shù)量最多(4793)。
　　3.C+VS M+共產(chǎn)生了

5、40，255條差異unigene，其中19，702條在C+下調(diào)表達(dá)，20,553條在C+上調(diào)表達(dá)。GO顯著富集分析表明蜂螨抗性及敏感性東方蜜蜂在受到蜂螨脅迫時(shí)體內(nèi)發(fā)生了不同的應(yīng)答反應(yīng)，而這些應(yīng)答反應(yīng)很可能伴隨轉(zhuǎn)錄因子的變化。多條顯著富集的pathway涉及病菌感染及抗菌物質(zhì)的生物合成，說明敏感性蜂群和抗性蜂群對(duì)病菌的抵抗力存在差異。
　　CVSM共有21，252條差異unigene，其中962條在C下調(diào)表達(dá)，20,290條在C上調(diào)

6、表達(dá)。GO顯著富集分析說明東方蜜蜂蜂螨抗性群體和敏感群體間存在免疫反應(yīng)、肌肉發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶方面的差異。有71個(gè)DEGs被富集到了嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，說明可能兩個(gè)群體間的嗅覺系統(tǒng)存在差異。
　　C+VS C共有36，691條差異unigene，其中17，799條在C+下調(diào)表達(dá)，18，892條在C+上調(diào)表達(dá)。GO顯著富集分析表明在蜂螨脅迫的情況下，東方蜜蜂產(chǎn)生了一定的應(yīng)答反應(yīng)，伴隨的可能為轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)差異。多條顯著富集的pathway

7、涉及病菌感染及抗菌物質(zhì)的生物合成，說明抗性群體在受到蜂螨脅迫時(shí)也同時(shí)受到了細(xì)菌的感染，同時(shí)通過自身免疫積極抵抗細(xì)菌。
　　M+VSM共有24，508條差異unigene，其中21，479條在M+下調(diào)表達(dá)，3029條在M+上調(diào)表達(dá)。GO顯著富集分析說明蜂螨敏感性蜂群在受到蜂螨脅迫時(shí)，其嗅覺功能發(fā)生了變化，可能形成了短期記憶，并伴隨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)差異。多條顯著富集的pathway涉及細(xì)菌及病毒感染，只有O聚糖生物合成(0.49％)與免

8、疫相關(guān)，說明敏感性群體對(duì)于細(xì)菌病毒的抵抗力低于抗性群體。
　　4.Venn分析關(guān)注到的差異基因中，在C+中呈現(xiàn)極高表達(dá)的DEGss（Log2 Ratio≥15）上調(diào)的270個(gè)，下調(diào)的8個(gè)，結(jié)合所有差異基因的GO及pathway顯著富集分析結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)以下基因與抗螨相關(guān):氣味結(jié)合蛋白、肌鈣蛋白、鈣離子運(yùn)輸ATPase、轉(zhuǎn)錄因子、免疫相關(guān)基因、表皮蛋白、突觸蛋白。
　　5.以東方蜜蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考序列，對(duì)四樣本

9、哺育蜂頭部蛋白質(zhì)進(jìn)行iTRAQ定量分析，共鑒定到1532個(gè)蛋白質(zhì)。GO分析顯示與細(xì)胞組分相關(guān)的表達(dá)蛋白最多的是細(xì)胞和細(xì)胞組分相關(guān)蛋白，共占61.02％。結(jié)合功能包含的蛋白數(shù)量最多(45.30％)。大部分蛋白參與到基本的生物學(xué)過程，如細(xì)胞進(jìn)程(20.01％)及代謝進(jìn)程(19.68％)。pathway分析發(fā)現(xiàn)共有1503條蛋白注釋到239個(gè)通路中，注釋到新陳代謝通路的蛋白最多，這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。
　　6.C+VSM+共產(chǎn)生了72個(gè)差

10、異蛋白，其中31個(gè)在C+下調(diào)表達(dá)，41個(gè)在C+上調(diào)表達(dá)。GO顯著富集分析說明蜂螨抗性及敏感性東方蜜蜂在受到蜂螨脅迫時(shí)體內(nèi)發(fā)生了不同的應(yīng)答反應(yīng)，這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也是相符合的。差異蛋白顯著富集的pathway為鞘脂類代謝。
　　CVSM共有154個(gè)差異蛋白，其中82個(gè)在C下調(diào)表達(dá)，72個(gè)在C上調(diào)表達(dá)。GO顯著富集分析說明蜂螨抗性東方蜜蜂和蜂螨敏感性東方蜜蜂的生命活力存在差異。差異蛋白顯著富集于17個(gè)pathway，最為顯著的是代謝途徑。

11、
　　C+VS C共有202個(gè)差異蛋白，其中81個(gè)在C+下調(diào)表達(dá)，121個(gè)在C+上調(diào)表達(dá)。GO顯著富集分析說明東方蜜蜂在受到蜂螨脅迫時(shí)體內(nèi)發(fā)生了一系列的代謝產(chǎn)能反應(yīng)及應(yīng)答反應(yīng)。差異蛋白顯著富集于14個(gè)pathway，最為顯著的為震顫性麻痹病。
　　M+VSM共有161條差異unigene，其中94個(gè)在M+下調(diào)表達(dá)，67個(gè)在M+上調(diào)表達(dá)。GO顯著富集分析說明蜂螨敏感性東方蜜蜂在受到蜂螨脅迫時(shí)，其生命活動(dòng)受到了影響，并且體內(nèi)發(fā)生

12、了一定的應(yīng)答反應(yīng)。差異表達(dá)蛋白顯著富集于25個(gè)pathway，最為顯著的為震顫性麻痹病。
　　7.韋恩分析及與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析顯示endocuticle structural glycoprotein SgAbd-2-like及obp13與抗螨相關(guān)。
　　8.將基于參考基因得到的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)，CVSM組中關(guān)聯(lián)性(r)為0.3269; rM+VSM為0.0066; C+VS M+為0.0737; C+VS

13、C為0.0774。結(jié)果表明兩者間相關(guān)性較低。
　　9.對(duì)嗅覺通路中的3個(gè)差異基因及其它與抗螨性狀相關(guān)的差異基因共15個(gè)DEGss進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示其表達(dá)規(guī)律與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是可靠的。對(duì)obp17，obp18及mklb-1編碼區(qū)進(jìn)行了克隆測(cè)序，獲得的obp17,obp18及mklb-1編碼區(qū)序列長度分別為408bp，399bp，4887bp。將東方蜜蜂obp4，obp17, obp18及mklb-