番茄SlCAT2基因的克隆及功能研究.pdf

1、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物體內(nèi)介導(dǎo)了氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著極其重要的作用。根據(jù)基因序列的同源性,將植物氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白劃分為兩大家族:ATFs(the amino acid transporter family)和APCs(the amino acid polyamine choline transporter),其中CATs(cationic amino acid transporters)亞家族分屬于APCs家族,植物體內(nèi)對(duì)AP

2、C家族成員的研究相對(duì)較少,其中主要研究也僅集中于CATs亞家族。
　　本研究從番茄基因組中分離了SlCAT2a與SlCAT2b兩個(gè)基因,分析了它們的基因序列特征以及蛋白結(jié)構(gòu)特征,構(gòu)建了CAT家族蛋白進(jìn)化樹(shù),對(duì)SlCAT2a蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析,分析了它們?cè)诜阎械臅r(shí)空特異表達(dá)模式,構(gòu)建了SlCAT2a與SlCAT2b基因超表達(dá)載體和反義抑制表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化番茄,并分析了SlCAT2a與SlCAT2b蛋白的底物特異性,初步研究Sl

3、CAT2a與SlCAT2b在番茄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1、通過(guò)基因序列同源比對(duì),在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中找到兩條可能為番茄SlCAT2蛋白的EST序列,分別命名為SlCAT2a、SlCAT2b,比對(duì)后發(fā)現(xiàn)從SlCAT2a第474個(gè)核苷酸和SlCAT2b第159個(gè)核苷酸開(kāi)始,二者的核苷酸序列完全一樣,僅5’端核苷酸序列存在差異,且SlCAT2a與SlCAT2b均位于10號(hào)染色體上,在基因組上的前10個(gè)外顯子

4、的位置完全一致。
　　2、采用 RT-PCR技術(shù)克隆SlCAT2a、SlCAT2b兩個(gè)基因全長(zhǎng)片段,SlCAT2a基因全長(zhǎng)1950bp,編碼650個(gè)氨基酸;SlCAT2b全長(zhǎng)1635bp,編碼545個(gè)氨基酸。通過(guò)生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)SlCAT2a蛋白有14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,而SlCAT2b蛋白含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。在CAT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中,SlCAT2a、SlCAT2b與擬南芥AtCAT2、楊樹(shù)PtCAT2蛋白同屬于第3亞類(lèi),通過(guò)Sl

5、CAT2a與GFP蛋白融合亞細(xì)胞定位進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SlCAT2a蛋白位于液泡膜上。
　　3、采用定量 PCR方法,對(duì)SlCAT2a、SlCAT2b基因進(jìn)行時(shí)空特異表達(dá)模式分析,結(jié)果表明SlCAT2a在生殖器官花中的表達(dá)量明顯高于其他組織,而SlCAT2b雖在各個(gè)組織均有表達(dá),但表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。進(jìn)一步檢測(cè)SlCAT2a、SlCAT2b在花中不同部分的表達(dá)特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn) SlCAT2a在雄蕊中表達(dá)量最高,在雄蕊、萼片、花瓣部分均微弱表

6、達(dá),SlCAT2b雖在花的不同部分均有表達(dá),但表達(dá)量同樣沒(méi)有明顯差異。
　　4、為了研究SlCAT2a、SlCAT2b基因的生物學(xué)功能,分別構(gòu)建了SlCAT2a、SlCAT2b基因超表達(dá)載體和AsCAT2反義抑制表達(dá)載體,對(duì)番茄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,通過(guò)GUS染色、PCR檢測(cè)、抗性篩選等多種方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定,并對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄中SlCAT2a、SlCAT2b的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。
　　5、對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)AsCA