和牛體細胞克隆技術的研究與應用.pdf

1、體細胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）是一項具有巨大應用前景的繁殖新技術，其在良種家畜擴繁、轉基因動物生產(chǎn)、珍稀物種保護、功能性藥物蛋白生產(chǎn)以及發(fā)育生物學、細胞生物學、胚胎學等眾多領域具有廣泛的潛在應用價值。因此， SCNT技術在科研、工業(yè)和農(nóng)業(yè)上可產(chǎn)生巨大經(jīng)濟效益。目前，利用SCNT技術獲得了大批克隆牛后代，然而牛SCNT技術的總體效率目前仍然很低，其整體效率只有5-10％。本論文旨在建立

2、日本黑毛和牛體細胞核移植胚胎技術方法，生產(chǎn)克隆胚胎并移植。本論文包括三個試驗，具體試驗內(nèi)容及獲得結果如下：（1）試驗1：研究并建立了成年和牛耳組織和胎兒組織2種成纖維細胞系，研究比較了這兩種細胞系的生長發(fā)育特征、形態(tài)和染色體的倍性，試驗結果表明，成年和牛和胎兒成纖維細胞系穩(wěn)定，具有正常的生物學特性；（2）試驗2：提高和牛體細胞核移植胚胎生產(chǎn)效率的研究。首先比較了來源于兩種不同供體細胞系（胎兒和耳部皮膚成纖維細胞）克隆胚胎的發(fā)育率，結果表

3、明，不同細胞系克隆胚胎的卵裂率和囊胚率差異不顯著；其次研究了冷凍方法對克隆胚胎發(fā)育效率的影響，試驗結果表明，使用90％細胞成簇生長時凍存的成纖維細胞做供體細胞，其卵裂率（90.7％）高于常規(guī)冷凍保存方法的供體細胞（84.4％），但兩者的囊胚率沒有顯著差異（27.2％和31.0％）；第三研究了不同去核方法對體細胞克隆胚胎生產(chǎn)的影響，結果表明，地美可辛（demecolcine）處理卵母細胞時，卵母細胞去核率(96.0％)高于對照組（79.5

4、％），但兩種去核方法的卵裂率和囊胚率沒有明顯差異。卵母細胞培養(yǎng)16 h后與地美可辛孵育2 h核脫出率（57.5％）高于對照組（4.7％）和其他方法（IVM16 h后，去除卵丘細胞并在DEM中培養(yǎng)2 h）（54.5％）；第四研究了徒手克隆方法對克隆胚胎生產(chǎn)效率的影響，結果表明，徒手無透明帶克隆方法的卵裂率和囊胚率（90.6％，27.5％）高于常規(guī)注射方法（63.8％和12.0％）。徒手克隆時，供體細胞雙細胞質融合（2胞質和1個供體細胞）的

5、卵裂率和囊胚率高與單細胞質融合（1胞質和1個供體細胞）。無透明帶和?？寺∧遗咭浦驳绞荏w牛，共有獲得4頭克隆犢牛后代（2犢牛來源于和牛耳成纖維細胞克隆胚胎，2犢牛來源于和牛胎兒成纖維細胞克隆胚胎），其中1頭犢牛出生時死亡，1頭犢牛出生后1周死亡；（3）試驗3：研究組蛋白脫乙酰酶抑制劑（HDACi）CUDC-101對和?？寺∨咛ンw外發(fā)育的影響。試驗結果表明，當用5μM以上CUDC-101處理供體細胞時，卵裂率，囊胚率和總細胞數(shù)均高于對照或2

6、μM CUDC-10組，但是，高濃度CUDC-101（大于100μM）處理和牛胚胎時，其發(fā)育率降低，當濃度為250和500μM時無克隆胚胎發(fā)育到囊胚階段。與對照或CUDC-101處理48 h相比，處理24 h時效果較好。定量PCR檢測結果表明，CUDC-101處理組Oct4和CDX2基因的表達水平顯著高于對照組，但是與早期胚胎表觀遺傳相關的DNMT1和HDAC1基因表達水平顯著下調(diào)。
　　本實驗建立了和牛體細胞克隆的技術方法。當9