乙草胺對(duì)斑馬魚的發(fā)育和生殖內(nèi)分泌干擾機(jī)制研究.pdf

1、酰胺類除草劑乙草胺是我國使用最多的三大除草劑之一，它通過抑制雜草體內(nèi)蛋白質(zhì)合成而起到除草作用。由于其具有中等到較高的水溶性，相對(duì)較低的土壤吸附性，因而施用到農(nóng)田后容易通過滲透轉(zhuǎn)移到淺層地下水或者隨雨水徑流進(jìn)入地表水，在環(huán)境中多次被檢出。EPA已將乙草胺列為B-2類致癌物。因此，乙草胺的毒理學(xué)研究對(duì)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有有者重要的意義。本文以模式生物斑馬魚為受試對(duì)象，從甲狀腺軸、性腺軸及抗氧化酶系等角度，研究乙草胺對(duì)斑馬魚內(nèi)分泌系統(tǒng)的干擾效應(yīng)，

2、并探討其潛在的作用機(jī)制。
　　本文采用QuEChERS和HLB固相萃取技術(shù)建立乙草胺和16種類固醇激素UHPLC-MS/MS檢測(cè)方法。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了儀器條件和樣品前處理方法，如SPE柱，淋洗劑、pH等。17種化合物在魚肉組織和水中的平均回收率分別為73.0～118.8％和70.3～117.1％，LOD分別為0.03～9.04 ng/g和0.01～0.98 ng/mL。該方法取得了良好的準(zhǔn)確度及精密度，為本文進(jìn)一步探索乙草胺對(duì)斑馬魚

3、類固醇激素的干擾作用提供了技術(shù)支持。
　　乙草胺對(duì)斑馬魚成魚急性毒性、胚胎急性毒性和致畸效應(yīng)以及生物富集實(shí)驗(yàn)表明:乙草胺對(duì)斑馬魚成魚96-h LC50為2.90mg/L，屬于中等毒性，在性腺中有檢出，但無富集;胚胎120-h LC50為5.09 mg/L，較成魚不敏感。乙草胺對(duì)斑馬魚胚胎6-120dph的曝露使胚胎存活率、孵化率降低，畸形率增加，引起包括身體彎曲和心包水腫等致畸現(xiàn)象。
　　研究了窗口期曝露乙草胺對(duì)斑馬魚的甲狀

4、腺系統(tǒng)內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。乙草胺(0、1、3、10、30、100和300μg/L)對(duì)斑馬魚仔魚7-21 dpf窗口曝露，高濃度組(30、100和300μg/L)致使T3水平顯著下降，T4水平顯著上升，體重增加。下丘腦—腦垂體—甲狀腺軸（HPT軸）中tsh，tra，tpo，slc5a上調(diào)和dio1，ugt1ab，ttr下調(diào)，基因變化與陽性對(duì)照T3曝露相似，表明乙草胺濃度的升高對(duì)斑馬魚甲狀腺系統(tǒng)產(chǎn)生了顯著的類似于T3的生長促進(jìn)效應(yīng)，其可能的作用

5、機(jī)制:乙草胺與T3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合使受體TRα上調(diào)干擾體內(nèi)T4/T3激素平衡，導(dǎo)致斑馬魚生長過速，進(jìn)而對(duì)下丘腦和垂體反饋調(diào)節(jié)增加，同時(shí)過度分泌促甲狀腺激素TSH加速了T4/T3的合成，并對(duì)甲狀腺器官功能可能產(chǎn)生不利的影響。
　　研究了短期曝露乙草胺對(duì)斑馬魚性腺系統(tǒng)的影響。乙草胺（0、0.03和0.3 mg/L）染毒14天后，雌魚的性腺、肝腺指數(shù)與對(duì)照組不存在顯著差異;卵巢中有乙草胺檢出，且隨之曝露時(shí)間的延長其含量有增加的趨勢(shì)。類固醇激素

6、T、E2、ASD的含量與空白對(duì)照相比均顯著下降，而17-OHP含量顯著升高。在基因轉(zhuǎn)錄水平上，乙草胺曝露使era、cyp17a1、 vtgⅠ和vtgⅡ顯著上調(diào)，ar、 apgr、cyp19a、cyp19b、17bhsd1和17bhsd3顯著下調(diào)。這些激素和基因變化與陽性對(duì)照E2曝露的結(jié)果相似。研究表明，乙草胺可能通過抑制17β-羥類固醇脫氫酶和芳香化酶CYP19活性，使雄烯二酮(ASD)轉(zhuǎn)化為睪酮(T)和雌二醇(E2)的過程受到抑制，降

7、低了體內(nèi)尤其是性腺中性激素T和E2的水平，同時(shí)通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制雄激素受體與T結(jié)合的方式，表現(xiàn)出抗雄激素效應(yīng)或類雌激素效應(yīng)。
　　研究了短期曝露乙草胺對(duì)斑馬魚抗氧化酶系和能量代謝酶的影響。結(jié)果顯示乙草胺（0、0.03和0.3 mg/L）14天曝露使斑馬魚雌魚肝臟中的SOD、CAT、POD、GST活性和GSH含量隨脅迫程度增加，表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì);MDA含量隨脅迫程度增加而上升;ATP酶、Na+ K+-ATP酶和Ca2+ Mg2+

8、-ATP酶活力隨脅迫程度增加均表現(xiàn)為抑制。表明外源污染物乙草胺對(duì)斑馬魚的氧化酶系和代謝酶具有氧化脅迫作用，其可能的作用形式:在肝臟中因代謝乙草胺產(chǎn)生了大量的自由基，低濃度時(shí)促使氧化酶系包括SOD、CAT、 POD和GST活性受到誘導(dǎo)，逐漸達(dá)到最高水平;同時(shí)，大量消耗能量(ATP)、進(jìn)而抑制ATP酶、Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶的活力。隨曝露時(shí)間和藥劑處理濃度的增加，大量的自由基無法被處在已飽和狀態(tài)的氧化酶系所催化，使

9、得自由基開始攻擊如氨基酸、酶等，致使酶活性降低。另一方面，大量的自由基產(chǎn)生，脂質(zhì)過氧化作用的增強(qiáng)，使MDA不斷累積，導(dǎo)致斑馬魚細(xì)胞膜脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)和DNA的發(fā)生氧化損傷和內(nèi)分泌平衡進(jìn)一步紊亂。
　　通過本論文的研究，從下丘腦—垂體—甲狀腺軸(HPT)、下丘腦—垂體—性腺軸(HPG)、抗氧化酶系等多角度較為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)了乙草胺對(duì)斑馬魚的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)并初步探討了其干擾作用的機(jī)制。研究結(jié)果表明環(huán)境中的乙草胺可能通過干擾甲狀腺素平衡、類固