大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇工藝研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇工藝研究姓名：王傳貴申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程指導(dǎo)教師：徐輝碧梅興國(guó)2000.11.1華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文140％，為非誘導(dǎo)組的3倍。該研究對(duì)于誘導(dǎo)子在誘導(dǎo)次生代謝的研究中誘導(dǎo)作用探討，提供了一種新的研究思路。為紫杉醇及其它植物次生代謝物的培養(yǎng)中誘導(dǎo)培養(yǎng)提供了一種新的培養(yǎng)1：藝。／3稀1：化臺(tái)物曾被J“泛應(yīng)川丁I農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的研究，但姓對(duì)丁植物扶生代謝的合成卻米得到重視。本文首次

2、將其作為一種誘導(dǎo)子概念提出并研究了其對(duì)紫杉醇的合成及釋放的fiOIJ。吐點(diǎn)研究了其托生物合成紫杉陣的培養(yǎng)‘I：藝中的作用。￡以四種紅豆杉懸浮細(xì)胞為利科，iJI：究了Laj‘的誘導(dǎo)效心。L一’(115pM230M)不但提高了紫杉孵的臺(tái)成，而且刺激了云南紅豆杉紫杉醇的胞外釋放。指數(shù)省長(zhǎng)后期加入58FIMLaj使紫杉醇的生產(chǎn)量達(dá)到最大，為對(duì)照組的三倍。但是當(dāng)濃度較高，如23uM和462uM時(shí)，細(xì)胞生物量的積累明顯降低。對(duì)于其他三種紅豆山細(xì)胞的

3、生物合成紫杉醇能力育不同程度的促進(jìn)作用。結(jié)果證明￡0對(duì)紅豆杉細(xì)胞紫杉醇的生物合成有非生物誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)作用同時(shí)，通過(guò)稀士化臺(tái)物與有機(jī)溶劑的結(jié)合應(yīng)用，觜杉醇很容易分配在培養(yǎng)基q，Jr進(jìn)而集中在第二項(xiàng)。另外研究了o|eicacid(3％，V／v)，tcrpin∞[(3％，V，v)錄l2(NH4)2S04ce(s04)2(2rag／|)的協(xié)同作Hj該體系使中國(guó)紅豆杉紫杉醇的生產(chǎn)量達(dá)到60mg／L’其中46％富集于第二項(xiàng)。J7刁4利剛DMSO和表

4、面括性劑Tw∞a80、部分無(wú)機(jī)鹽、甘露醇或山梨醇滲透壓沖擊，確定了刺激紫杉醇釋放與合成的方式f另外。超聲波被首次應(yīng)用與植物次生代謝的合成及釋放研究。剛38kHz。120秒的趣聲強(qiáng)度處理懸浮細(xì)胞，紫杉醇的生產(chǎn)和胞外釋放都明顯升高。同時(shí)分析了超聲波對(duì)中國(guó)紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生理生化指標(biāo)及紫杉醇臺(tái)成的影響。超聲波處理植物細(xì)胞提供了在保持細(xì)胞生長(zhǎng)的前提下有效刺激胞內(nèi)次生代謝物的簡(jiǎn)易操作方法。通過(guò)以上的研究為實(shí)現(xiàn)半連續(xù)化和連續(xù)化紫杉醇放大培芥拋|

5、：j了衙刪帕l：藝研究基礎(chǔ)，5比較了中國(guó)紅豆杉細(xì)胞在用棉耗塞或鋁鉑紙密封的不同培養(yǎng)體積的搖瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)與臺(tái)紫杉酵的合成培養(yǎng)并對(duì)懸浮細(xì)胞在自治的攪拌式反應(yīng)器河內(nèi)循環(huán)氣升式反應(yīng)器進(jìn)行了10L規(guī)模的放大培養(yǎng)I對(duì)于同等培養(yǎng)體積的不同塞子的搖瓶中培養(yǎng)，棉塞q鋁薄紙塞對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和l紫杉醇臺(tái)成影響差異極小。不同體積的搖瓶對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和紫杉醇合成影響不明顯。但是，搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞的生物量明顯比上兩種反應(yīng)器的生物量高40～20％。紫杉醇的產(chǎn)量放人J亓明顯降低

6、攪拌式反應(yīng)器尤其明顯攪拌和氣泡形成的封切脅地時(shí)細(xì)胞生妖及紫杉醇的生產(chǎn)的抑制育主嬰作塒廠y6綜合誘導(dǎo)子、紫杉醇合成的生物前體、旁路抑制荊、紫杉醇釋放刺激等因子，通過(guò)正交試驗(yàn)研究了確定了提高紫杉醇生物合成代謝的調(diào)節(jié)方法并提出了用于實(shí)現(xiàn)兩段法細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的生產(chǎn)培養(yǎng)基1將生產(chǎn)培養(yǎng)基結(jié)合兩相培養(yǎng)系統(tǒng)成功地完成了在鼓泡式反府器的放大。在反應(yīng)器中培養(yǎng)20多批次40m以以上3罐IOmg／L以上2礎(chǔ)兒，州相培袢三蛐r有2、蛐椏40mg／L以上(最靳