豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的高效可溶性表達(dá)和檢測(cè)血清抗體的間接ELISA方法的建立.pdf

1、揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因的高效可溶性表達(dá)和檢測(cè)血清抗體的間接ELISA方法的建立姓名：陳義平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：劉秀梵20030501揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文核表達(dá)，其中部分報(bào)道還對(duì)核衣殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)方式進(jìn)行了分析，結(jié)果均是以包涵體形式存在。本試驗(yàn)將美洲型P R R S V V R2 3 3 2 株核衣殼蛋白基因克隆到表達(dá)載體p G E X 一6 P 一1 中谷胱甘肽一s

2、 一轉(zhuǎn)移酶( G S T ) 基因的下游，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌B L 2 1 ，通過(guò)對(duì)各種表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了P R R S V 核衣殼蛋白基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)。經(jīng)S D S —P A G E 和W e s t e r nb l o t 分析，G S T —N 融合蛋白的分子量約為3 9 ．5 k D a ，另外，還有三種不同大小的G S T —N 降解產(chǎn)物，分子量分別為3 3k D a ，3 0 ．5k D a 和2

3、7 ．5k D a ，3 9 ．5k D a 的G S T —N 及其3 0 ．5k D a 的降解產(chǎn)物分別占菌體蛋白的3 0 ．9 ％和1 5 ．3 ％，總表達(dá)量約占菌體蛋白的一半。重組菌經(jīng)超聲波裂解后，用G l u t a t h i o n e S e p h a r o s e4 B 親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物，每毫升床體積的G S T - N 融合蛋白收獲量達(dá)1 5 m g ，回收的G S T - N 融合蛋白濃度達(dá)到8 m g ／

4、m 1 。用P r e S c i s s i o nP r o t e a s e 切去G S T —N 融合蛋白中的G S T 成分，得到純化的重組核衣殼蛋白。經(jīng)間接E L I S A 證實(shí)，大腸桿菌中表達(dá)的G S T —N 融合蛋白以及切去G S T 純化的N 蛋白均可作為診斷抗原，用于P R R S V 抗體的檢測(cè)。用G S T - N 融合蛋白以及切去G S T 后純化的N 蛋白免疫B A L B ／c 小鼠制備的抗血清均能與

5、S f 9 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組核衣殼蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，可見(jiàn)P R R S V 核衣殼蛋白的原核表達(dá)產(chǎn)物也具有良好的免疫原性。三、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體間接E L I S A 檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用分別用昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組核衣殼蛋白( B a c - N ) 、大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的G S T —N融合蛋白、以及切去G S T 后純化的N 蛋白作為診斷抗原，同時(shí)設(shè)立必要的陰性抗原對(duì)照，結(jié)果可見(jiàn)B a c - N 、G S T - N 以及

6、N 蛋白均能特異性地識(shí)別P R R S V 抗體陽(yáng)性血清樣品和陰性血清樣品，而且根據(jù)針對(duì)陰性抗原以及陰性抗體反應(yīng)的o D 值可見(jiàn)，三種檢鋇4 用抗原都具有較高的敏感性。因此，B a c - N 、G S T —N 、N 蛋白均可作為診斷抗原，用于P R R S V 抗體檢測(cè)。但考慮到B a c —N 為昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解后的粗提制劑，含有較多的細(xì)胞蛋白成分，需設(shè)立正常S f 9 細(xì)胞裂解上清作為陰性抗原對(duì)照，同一份血清樣品要對(duì)陽(yáng)性抗原和陰性抗

7、原同時(shí)進(jìn)行平行檢測(cè)，而上述N 蛋白純化抗原的制各需要蛋白酶P r e S c i s s i o nP r o t e a s e 的切割，從而大大增加了抗原制備的經(jīng)費(fèi)開(kāi)支，因此選用親和層析純化的G S T —N 作為檢鍘抗原。以方陣滴定法確定G S T —N 最佳包被濃度為每孔4 0 0 n g ，待檢血清最佳稀釋度為1 ：i 0 0 。血清樣品的0 D ?！軴 ．4 3 X O D ，．+ O ．5 7 ×o D k 判為