番茄內(nèi)生細(xì)菌Eb-28對(duì)番茄灰霉病菌抑制作用研究.pdf

1、本研究首先以黃瓜子葉法為基礎(chǔ)，以化學(xué)藥劑為材料，建立番茄灰霉病藥劑篩選體系，分別從不同黃瓜品種、不同葉齡、不同菌齡、不同培養(yǎng)條件、不同施藥方法等方面進(jìn)行測(cè)試，針對(duì)灰霉病菌建立了簡(jiǎn)便、快速的殺菌劑生測(cè)方法。該體系可概括為:黃瓜選用對(duì)Botrytis cinema Pers.中等感病品種長(zhǎng)春密刺，葉齡為8d左右，菌齡1d的幼齡菌絲，噴霧法施藥，0.5％水瓊脂保濕，24℃光照培養(yǎng)，接種后24～36h測(cè)量結(jié)果。應(yīng)用此法首先測(cè)試了4種化學(xué)藥劑，2

2、％恩澤霉水劑、25％菌思奇乳油、50％速克靈可濕性粉劑和140％施佳樂(lè)懸浮劑對(duì)番茄灰霉病的防治效果，檢驗(yàn)了測(cè)試體系的穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上，利用該體系從3株植物內(nèi)生菌中篩選到一株對(duì)狄霉病菌有強(qiáng)烈抑制作用的菌株Eb-28菌株，該菌株由番茄莖分離獲得。 對(duì)Eb-28菌株培養(yǎng)條件的研究表明，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基的酸堿度以及通氣量對(duì)菌株生長(zhǎng)都有影響，確定其最佳培養(yǎng)條件為:30℃下培養(yǎng)時(shí)間為48h，初始pH值為6.0，通氣量為175mL

3、/250mL。 采用常規(guī)方法結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)Eb-28菌株進(jìn)行了鑒定。根據(jù)Eb-28菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀以及生理生化反應(yīng)，結(jié)合伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)，初步將此菌株鑒定為芽孢桿菌屬。16S rDNA序列分析表明Eb-28菌株的16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌同源性為99％，最終鑒定其為枯草芽孢桿菌。 本研究表明，Eb-28菌株在離體葉片上對(duì)番茄灰霉病病斑擴(kuò)展抑制率為51.68％。該菌株的發(fā)酵濾液對(duì)灰霉病菌抑

4、菌圈直徑達(dá)到20mm以上，經(jīng)121℃滅菌的濾液則無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，說(shuō)明發(fā)酵液中的活性成分在121℃滅菌后失活。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中活性物質(zhì)可造成病原菌菌絲體原生質(zhì)凝結(jié)，菌絲體畸形，不正常膨大。內(nèi)生菌Eb-28菌株粗蛋白的提取采用(NH4)2SO4分級(jí)鹽析法，(NH4)2SO4飽和度為60％時(shí)抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)25mm。且上清液無(wú)活性，可見(jiàn)活性物質(zhì)均已被沉淀，為蛋白類物質(zhì)。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，抑菌圈周圍受抑制菌絲畸形，原生質(zhì)凝結(jié)，與發(fā)酵濾

5、液對(duì)菌絲的影響一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，此粗蛋白抑菌活性在近中性至堿性條件下(pH值6.6～10.6)抑菌圈直徑均達(dá)到20mm以上，pH值在6.6以下粗蛋白抑菌活性顯著降低。粗蛋白經(jīng)40，60，80℃處理后，抑菌活性與4℃對(duì)照無(wú)顯著差異，其抑菌圈直徑均在20mm以上。100℃處理20min后粗蛋白抑菌活性與對(duì)照相比顯著下降，抑菌圈直徑為16mm。經(jīng)紫外線處理12h后，抑菌活性與對(duì)照相同，抑菌圈直徑均為21mm。結(jié)果表明，粗蛋白在80℃以下有