12854.木質(zhì)纖維素依賴型pediococcusacidilacticidq2中外源功能基因的表達(dá)及基因敲除

1、分類號(hào)：壘盈密級(jí)：UDC：華東理工大學(xué)學(xué)位論文木質(zhì)纖維素依賴型PediococcusacidilacticiDQ2中外源功能基因的表達(dá)以及基因敲除涂毅指導(dǎo)教師姓名：鮑杰教授華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)名稱：生物化工論文定稿日期：2013426論文答辯日期：2013531學(xué)位授予單位：華東理王太學(xué)學(xué)位授予日期：瑜橢6弱2確答辯委員會(huì)主席：盧艷花評(píng)閱人：張惠展周志華華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第1頁(yè)木質(zhì)纖維素依賴型Pedioc

2、occusacidilacticiDQ2中外源功能基因的表達(dá)以及基因敲除摘要乳酸片球菌PediococcusacidilacticiDQ2是一株耐高溫和耐木質(zhì)纖維素降解抑制物的乳酸高產(chǎn)菌株。本文從兩個(gè)角度對(duì)PacidilacticiDQ2進(jìn)行了改造，使其能夠更為適合于木質(zhì)纖維素生物煉制加工過(guò)程。首先，在PacidilacticiDQ2中建立了外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。對(duì)常用的乳酸菌表達(dá)載體pMG36e進(jìn)行改造，將其啟動(dòng)子P32更換為來(lái)源于Pac

3、idilacticiDQ2的L哥L酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子P7拋。并通過(guò)新載體pTY36e成功表達(dá)了兩種不同的外源基因：綠色熒光蛋白基因gfp(Aequoreavictoria)和B一葡萄糖苷酶基因培IA(Bacilluspolymyxa1794)，其中所表達(dá)的胞內(nèi)p葡萄糖苷酶活力為448U／(gdrycells)。此系統(tǒng)的成功構(gòu)建為后續(xù)對(duì)該菌的基因工程改造奠定了基礎(chǔ)。其次，對(duì)PacidilacticiDQ2染色體上的D乳酸脫氫酶基因ldh

4、D進(jìn)行敲除以生產(chǎn)光學(xué)純的L一乳酸。將熱敏型敲除質(zhì)粒pSET4S上的壯觀霉素抗性基因更換成紅霉素抗性，并通過(guò)新質(zhì)粒pSET4E構(gòu)建敲除載體進(jìn)行聊國(guó)的敲除。結(jié)果顯示，敲除菌株P(guān)acidilacticiAldhD112所產(chǎn)L一乳酸的光學(xué)純度達(dá)到9988％，并且在其胞內(nèi)幾乎檢測(cè)不到D乳酸脫氫酶酶活。由于D乳酸為此PacidilacticiDQ2菌株細(xì)胞壁肽聚糖的組成成分，對(duì)D一乳酸的消除使突變株對(duì)萬(wàn)古霉素的抗性急劇的下降。AldhD112的構(gòu)建