蘋果炭疽葉枯病菌致病相關(guān)基因GcVIR1的克隆及功能分析.pdf

1、近幾年，蘋果一種重要的新病害——蘋果炭疽葉枯?。℅lomerella leaf spot of apple），在我國蘋果主產(chǎn)區(qū)連年大發(fā)生，給蘋果產(chǎn)業(yè)帶來巨額損失。目前，關(guān)于該病害的研究主要集中在病原學(xué)、病害發(fā)生規(guī)律和防治方法，而關(guān)于病原菌致病的分子基礎(chǔ)研究較少。本研究開展了蘋果炭疽葉枯病菌致病機(jī)理研究，旨為該病害防治的新途徑、新方法提供線索。
　　本研究首先對T-DNA插入突變體庫中的部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)性狀觀測，獲得與野生型菌株培

2、養(yǎng)性狀差異較大的菌株7株。其中突變體M22和M178的產(chǎn)孢量為野生型的10倍，突變體M17和M44失去了產(chǎn)孢能力，其他3株突變體的產(chǎn)孢量約為野生型的1％。致病力測定結(jié)果表明，7株突變體的致病能力均有下降，其中M44和M285完全失去了致病能力。Southern blot分析結(jié)果顯示，7株突變體基因組中的T-DNA均是單拷貝插入。為分離因T-DNA插入受到影響的基因，本研究運(yùn)用hiTail-PCR技術(shù)，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，獲得了T

3、-DNA插入點(diǎn)的右翼序列，經(jīng)與圍小從殼菌菌株23基因組比對分析，獲知突變體可能受到影響的基因分別為GcRRN3，GcRXT2，GcGD1，GcCON3，GcOPT2，GcMRP1和GcVIR1。為進(jìn)一步鑒定候選基因，本研究采用RT-PCR技術(shù)對7個候選基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了檢測，7個基因在野生型菌株W16中均能擴(kuò)增出單一條帶，然而在各自突變體中無條帶出現(xiàn)，表明7個候選基因在各自突變體中轉(zhuǎn)錄受到抑制。
　　本研究其次對GcVIR1基因

4、進(jìn)行了深入分析。該基因全長1686bp，不含有內(nèi)含子，編碼562個氨基酸。為進(jìn)一步明確GcVIR1基因的功能，本研究構(gòu)建了GcVIR1基因恢復(fù)載體，并借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)（ATMT）成功將GcVIR1基因轉(zhuǎn)入GcVIR1突變體M285基因組中，獲得了GcVIR1基因恢復(fù)菌株R-GcVIR1。表型測定結(jié)果顯示，恢復(fù)菌株R-GcVIR1完全恢復(fù)了GcVIR1突變體M285的表型缺陷。為了確定GcVIR1蛋白的亞細(xì)胞定位，我們構(gòu)建了G

5、cVIR1-RFP融合表達(dá)的GcVIR1恢復(fù)菌株R-VIR1RFP。熒光顯微鏡下檢測結(jié)果表明，GcVIR1分布于細(xì)胞質(zhì)中。為明確GcVIR1在該菌中的時(shí)空表達(dá)模式，本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測了GcVIR1在菌絲、分生孢子、芽管和附著胞的表達(dá)量，結(jié)果顯示，GcVIR1在蘋果炭疽葉枯病菌各個發(fā)育階段都有表達(dá)，在分生孢子中相對表達(dá)量最高。
　　膠胞炭疽菌通過分泌果膠酶（聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶和果膠酸酯裂解酶），克服寄主細(xì)胞壁中

6、的果膠，使其成功在寄主體內(nèi)定殖。在本研究中，GcVIR1突變體失去了致病能力，因此我們利用qRT-PCR技術(shù)檢測了果膠酶合成相關(guān)基因PG1、PG2、pnl-1、pnl-2和pelB在突變體M285中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PG1基因表達(dá)量升高至5.89倍，PG2基因表達(dá)量升高至4.58倍，其他3個基因與野生型菌株無差異。表明GcVIR1負(fù)調(diào)控PG1和PG2基因的表達(dá)。在膠孢炭疽菌中，由附著胞調(diào)節(jié)的侵入方式在其致病過程中起到重要作用，而絲裂

7、原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯(lián)信號途徑中相關(guān)基因CMK1、CPK1、MEK1和MAF1被證實(shí)在這一過程中起到重要的調(diào)控作用?？紤]到GcVIR1突變體失去了產(chǎn)生附著胞的能力，本研究利用qRT-PCR技術(shù)檢測了這些基因在突變體M285中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CMK1、CPK1、MEK1和MAF1在突變體M285中表達(dá)量（與野生型相比）無明顯變化，因此，推測GcVIR1基因在功