SARS冠狀病毒BJ01株全長cDNA的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)錄體感染性觀察.pdf

1、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約29,700nt，是目前所知的RNA病毒中基因組最大的一類病毒。序列分析表明，SARS病毒明顯區(qū)別于所有已測序的冠狀病毒，其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系不屬于目前已知的3組冠狀病毒中的任何一組，為一獨(dú)立的分支。目前對SARS-CoV的基因組結(jié)構(gòu)與功能、致病的分子機(jī)理等了解甚少，反向遺傳學(xué)技術(shù)可為深入開展這一領(lǐng)域的研究提供良好的技術(shù)支持。 反向遺傳學(xué)技術(shù)是指由病毒的cDNA克隆

2、獲取RNA病毒的一項(xiàng)技術(shù)，包括病毒基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建和感染性轉(zhuǎn)錄體的制備。但由于冠狀病毒基因組較大，目前無法直接用PCR技術(shù)擴(kuò)增出全長cDNA分子，而且構(gòu)建基因組全長cDNA克隆必須使用大容量的載體，這就使全長cDNA克隆的構(gòu)建較為困難。因此，本研究采用分段克隆、體外拼接及體外轉(zhuǎn)錄的策略開展了SARS病毒感染性轉(zhuǎn)錄體的制備工作。 首先，對RT-PCR擴(kuò)增SARS病毒基因組長片段cDNA的條件進(jìn)行了優(yōu)化。利用RNA制備試

3、劑盒從病毒感染的細(xì)胞中提取總RNA，以SuperscriptⅡ進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA，然后用LADNATaq聚合酶進(jìn)行cDNA片段的擴(kuò)增。反應(yīng)體系中采用不同的Mg2+、dNTP、引物和模板濃度以及不同的反應(yīng)參數(shù)分別進(jìn)行長片段cDNA的擴(kuò)增，最終確定了擴(kuò)增SARS病毒基因組長片段cDNA的最佳反應(yīng)體系和參數(shù)：10×Buffer(Mg2+，37.5mM)緩沖液5μL，dNTP(10mM)2μL，LATaq聚合酶(2.5u)1μL，上

4、下游引物各1.5μL，模板2μL，加水至50μL。擴(kuò)增條件為：94℃2min;94℃30s,55℃45s,72℃3.5～7min(依片段長度而定，1kb約需1min)，擴(kuò)增28個循環(huán)，每個循環(huán)延伸時間遞增1s；最后72℃延伸7min，4℃保存。該反應(yīng)條件具有很好的重復(fù)性。 其次，對病毒全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增和克隆。利用SARS病毒BJ01株基因組序列上的特異酶切位點(diǎn)(BglI)和采用沉默突變引入BglI位點(diǎn)的方法設(shè)計(jì)了7對引物。擴(kuò)

5、增的7個cDNA片段其大小分別為1.5kb，2.8kb，4.3kb，3.3kb，6.Skb，4.5kb和6.3kb。同時，在基因組5’端引入T7啟動子核心序列，以使其能夠進(jìn)行全長cDNA分子的體外轉(zhuǎn)錄。將擴(kuò)增的覆蓋病毒全基因組的7個cDNA片段進(jìn)行回收純化后，分別將F1片段克隆至pGEM-TEasy載體，將F2～F6克隆至pCR-XL-TOPO載體，將F7克隆至pWSK29載體構(gòu)建SARS病毒亞cDNA克隆，并通過序列測定進(jìn)行陽性克隆的

6、篩選。最終構(gòu)建出了F1-3-Teasy，F(xiàn)2-6-Topo，F(xiàn)3-17-Topo，F(xiàn)4-10-Topo，F(xiàn)5-1-Topo，F(xiàn)6-7-Topo和F7-pWSK297個重組質(zhì)粒。 在此基礎(chǔ)上，對7個重組質(zhì)粒進(jìn)行大量提取、純化、酶切和回收。然后分別將F1～F4和F5～F7進(jìn)行體外連接獲得SARS病毒基因組5’和3’端半分子cDNA，并對接頭處序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列測定。再將5’和3’端半分子cDNA進(jìn)行體外連接，從而獲得了SAR

7、S病毒BJ01株基因組全長cDNA分子。以獲得的全長cDNA分子為模板直接進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞后每天觀察細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果在轉(zhuǎn)染后84h，細(xì)胞出現(xiàn)空泡、聚集成團(tuán)、變圓拉網(wǎng)等細(xì)胞病變。將收集的病毒培養(yǎng)液上清重新接種Vero-E6細(xì)胞進(jìn)行觀察，在72h后也出現(xiàn)相同的細(xì)胞病變效應(yīng)。從出現(xiàn)病變的細(xì)胞中提取總RNA，對恢復(fù)病毒基因組序列的13038～14170nt和27229～28332nt兩個區(qū)段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和測序，結(jié)