原料奶中熒光假單胞菌耐熱性脂肪酶周質(zhì)表達(dá)及酶學(xué)特性研究.pdf

1、首先，建立了一個(gè)快速、靈敏度高的乳制品脂肪酶活檢測(cè)方法。在實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，從原料奶中分離出了一株產(chǎn)耐熱性脂肪酶的嗜冷菌，后經(jīng)鑒定為熒光假單胞菌，并編號(hào)為B J-10（Pseudomonas fluorescensBJ-10）。在獲得此菌的基礎(chǔ)上，本文以其耐熱性脂肪酶(lipBJ10)為研究目標(biāo)，以大腸桿菌為表達(dá)宿主菌對(duì)其進(jìn)行過表達(dá)。采用信號(hào)肽融合表達(dá)技術(shù)實(shí)現(xiàn)lipBJ10可溶性、功能性的表達(dá)，探究了不同分泌類型的信號(hào)肽對(duì)于lipBJ

2、10周質(zhì)分泌的影響，篩選出lipBJ10周質(zhì)表達(dá)的最佳信號(hào)肽。優(yōu)化了最適周質(zhì)表達(dá)條件，建立了高效、可行的分離純化策略，并研究了lipBJ10的酶學(xué)特性。
　　本研究的主要結(jié)論如下:
　　(1)建立了乳制品中脂肪酶高通量快速檢測(cè)方法:即利用含檸檬酸鈉的緩沖液澄清牛乳，除去乳脂肪的同時(shí)使難溶的酪蛋白膠束分散溶解，為分光光度法的應(yīng)用制備出澄清的檢樣，以便于能夠使用分光光度法直接檢測(cè)脂肪酶活。在脂肪酶檢測(cè)過程中，步驟少、簡(jiǎn)單、易于操

3、作、所需樣品和試劑少。該方法線的性相關(guān)性好、檢測(cè)靈敏度高，能夠應(yīng)用于檢測(cè)市售的不同液態(tài)奶制品脂肪酶活，如巴氏奶和UHT奶。
　　(2)克隆出了lipBJ10的全長(zhǎng)核酸序列，并經(jīng)過同源比對(duì)確定其為脂肪酶超家族的第一大族I族脂肪酶，具體為I.3亞族。核酸和蛋白序列已經(jīng)提交NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號(hào)為:KY939609。
　　(3)通過對(duì)比，溫度對(duì)過表達(dá)可溶性的lipBJ10的影響大于IPTG誘導(dǎo)濃度;在最適發(fā)酵溫度20

4、℃下，低IPTG誘導(dǎo)濃度有利于生成功能性lipBJ10。
　　(4)融合表達(dá)能夠有效的增強(qiáng)目標(biāo)蛋白質(zhì)的可溶性，提高lipBJ10的酶活性。當(dāng)lipBJ10與DsbA融合表達(dá)時(shí)，周質(zhì)酶活性達(dá)到最高的26541U/ml。經(jīng)過綜合分析，DsbA是最適融合表達(dá)lipBJ10的信號(hào)肽。
　　(5)使用響應(yīng)面法優(yōu)化了lipBJ10的表達(dá)條件，構(gòu)建了一個(gè)可靠、準(zhǔn)確的模型，建立了三因素的回歸擬合方程:Y(脂肪酶活/(U/ml))=27028

5、+2419A-18.82B-583C-55.98AB-3142AC+219BC-53.58A2-608B2-3184C2，其中，A代表溫度，B代表IPTG誘導(dǎo)濃度，C代表誘導(dǎo)時(shí)間?；貧w方程推測(cè)出的最佳過表達(dá)條件如下:誘導(dǎo)溫度2278℃、IPTG誘導(dǎo)濃度016mM、誘導(dǎo)時(shí)間381小時(shí)。該模型預(yù)測(cè)出的理論最大周質(zhì)脂肪酶活性為282.019U/ml。經(jīng)過驗(yàn)證，優(yōu)化出的表達(dá)條件可靠。
　　(6)采用兩步法，先親和層析后凝膠過濾層析，成功的

6、分離純化出純度很高的lipBJ10樣品，為重組蛋白質(zhì)的分離純化提供了一個(gè)值得借鑒參考的方法和策略。
　　(7)酶學(xué)性質(zhì)研究表明lipBJ10是一種堿性脂肪酶，其最適pH值為8.6左右，最適溫度為45℃。Ca2+能顯著的提高lipBJ10的酶活性。EDTA能夠降低lipBJ10的酶活性，可能與脂肪酶結(jié)構(gòu)中Ca2+的被螯合有關(guān)。重金屬離子能夠顯著的使lipBJ10喪失大部分酶活性。非離子型表面活性劑Triton X-100和陰離子表面