耐熱脂肪酶-酯酶基因資源的挖掘與研究.pdf

1、脂肪酶/酯酶作為一類(lèi)重要的工業(yè)用酶在眾多領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。自然界中許多動(dòng)物、植物、微生物均產(chǎn)脂肪酶/酯酶。目前，商品化的脂肪酶/酯酶主要來(lái)自于微生物。然而，現(xiàn)有商品化脂肪酶/酯酶數(shù)量少、價(jià)格貴，且多數(shù)在熱穩(wěn)定性及酸、堿、有機(jī)溶劑耐受性等方面表現(xiàn)不佳，因而促使人們不斷地開(kāi)發(fā)更多具有不同特性的新型脂肪酶/酯酶以適應(yīng)各種工業(yè)應(yīng)用需求。本論文擬以極端微生物和宏基因組為研究對(duì)象，利用基因組和宏基因組挖掘技術(shù)挖掘耐熱脂肪酶/酯酶資源，以期獲得具有優(yōu)

2、良特性和工業(yè)應(yīng)用前景的脂肪酶/酯酶。主要研究工作和結(jié)果摘要如下：
　　1.利用基因組挖掘技術(shù)獲取了極端耐輻射球菌Deinococcus radiodurans四種脂肪酶（DR0334、DR1485、DR2078和DR2522）基因信息，并通過(guò)異源表達(dá)和純化獲得了四種純度較高的重組脂肪酶。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：DR0334、DR1485、DR2078和DR2522均對(duì)短鏈對(duì)硝基苯酚酯表現(xiàn)出偏好性，其最適pH均為8.5，最適反應(yīng)溫度分別為

3、40 oC,50 oC,60 oC和60 oC。DR0334于60 oC處理1 h后幾乎完全喪失活性，而其他三種重組酶在80 oC處理6 h后還能保持70％以上的殘余酶活，且對(duì)有機(jī)溶劑也表現(xiàn)出中等程度的耐受性。進(jìn)化樹(shù)分析顯示：DR1485和DR2078分別屬于脂肪酶第IV家族和第IX家族成員，而DR0334和DR2522則分別代表了新的脂肪酶家族。
　　2.利用宏基因組技術(shù)構(gòu)建了造紙廠活性污泥宏基因組文庫(kù)，并利用三丁酸甘油酯平板篩

4、選獲得一酯酶基因est-XG2（NCBI登錄號(hào)：KC904273），并對(duì)其進(jìn)行了異源表達(dá)、性質(zhì)研究、分類(lèi)鑒定和結(jié)構(gòu)模擬。該基因含有1506 bp，編碼蛋白含501個(gè)氨基酸殘基。序列比對(duì)顯示，Est-XG2與來(lái)自Thermaerobacter marianensis DSM12885的酯酶（NCBI登錄號(hào)：YP_004101478）具有最大相似性（identity:47%）。酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定表明：Est-XG2具有水解中短鏈對(duì)硝基苯酚酯的能力

5、，其最適底物對(duì)硝基苯酚乙酸酯的Km和kcat值分別為0.33 mM和36.21 s-1，最適pH為8.5，最適溫度為70 oC。熱穩(wěn)定性研究表明Est-XG2具有較強(qiáng)熱穩(wěn)定性，且其對(duì)有機(jī)溶劑表現(xiàn)出較強(qiáng)耐受性。Est-XG2的催化三聯(lián)體由Ser192、Glu313和His412三個(gè)氨基酸殘基組成，并通過(guò)定點(diǎn)突變進(jìn)行了驗(yàn)證。進(jìn)化樹(shù)分析顯示Est-XG2屬于脂肪酶第VII家族成員。此外，Est-XG2還具有水解芳樟醇酯的能力。上述特性表明Es

6、t-XG2具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
　　3．利用基因組挖掘技術(shù)從嗜熱古菌Pyrobaculum sp.1860中獲得了一酯酶基因（Uniprot:G7VG08，P186_1588），通過(guò)異源表達(dá)與純化獲得了純度較高的重組酯酶（rP186_1588）并對(duì)其進(jìn)行了Western-blot和質(zhì)譜鑒定。性質(zhì)研究表明：rP186_1588只能水解中短鏈（C2-C10）對(duì)硝基苯酚酯，最適底物為對(duì)硝基苯酚乙酸酯（Km為0.35 mM，kcat為

7、11.65 s-1），最適pH為9.0，最適溫度為80 oC。熱穩(wěn)定性測(cè)定表明，rP186_1588在90 oC條件下處理6 h后仍能保持70%左右的殘余酶活，且圓二色譜分析進(jìn)一步證明了其具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。此外，rP186_1588能夠被丙酮和甲醇激活。rP186_1588的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性提示其具有一定的應(yīng)用潛力。
　　4．利用同源建模方法獲得了質(zhì)量較高的上述古菌酯酶P186_1588三級(jí)結(jié)構(gòu)，其三級(jí)結(jié)構(gòu)具有典型的α/

8、β水解酶特征，由6個(gè)α-螺旋和7個(gè)β-折疊組成，其中α-螺旋位于β-折疊兩側(cè)，之間由多個(gè)loop結(jié)構(gòu)連接而成。不同溫度（300 K、353 K、373 K和473 K）條件下的分子動(dòng)力學(xué)模擬揭示，P186_1588的熱穩(wěn)定性與其結(jié)構(gòu)中大部分區(qū)域的剛性特征有關(guān)，其柔性區(qū)域主要分布在64-66和144-155位殘基之間。此外，P186_1588中的四對(duì)鹽橋（Arg14-Asp35、Arg114-Asp90、Lys178-Asp169和Arg