股骨頭缺血性骨壞死骨細胞凋亡與Bcl-2、Bax表達的相關性研究.pdf

1、缺血性骨壞死目前已成為一種常見病，尤其是股骨頭壞死致殘率最高。目前對該病的認識有了很大的提高，但其發(fā)病機制尚未完全明了，除已知創(chuàng)傷等病因外，其余病因和發(fā)病機理復雜而不明確。對其發(fā)生機制國內(nèi)外學者進行了基礎和臨床研究，提出了各種學說，從不同的側面闡述了各自的觀點。盡管非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病理機制仍不清楚，但與創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病理改變十分相似，認為均由于局部缺血后，骨及骨髓成分出現(xiàn)壞死。以細胞學及分子生物學為基礎來闡述其病理改變有助于對非

2、創(chuàng)傷性股骨頭壞死病理機制的了解。缺血是凋亡的常見誘導因素之一，目前腦缺血誘導神經(jīng)細胞凋亡方面的文獻較多，在缺血性損傷研究中，心、肝、腎等臟器的細胞死亡亦與細胞凋亡有關，但缺血后骨組織是否存在凋亡國內(nèi)外未見報導，了解局部缺血后骨組織內(nèi)細胞凋亡情況，探明缺血性骨壞死的發(fā)病機制具有重要意義。本實驗通過建立缺血性骨壞死的動物模型及觀察由于股骨頸骨折行人工關節(jié)置換時取出的股骨頭，檢測骨組織中是否存在細胞凋亡及缺血時間與凋亡程度的關系，并在此基礎上

3、進一步觀察Bcl-2、Bax免疫反應陽性細胞與凋亡細胞的相關性，旨在探討B(tài)cl-2，Bax對缺血性骨組織細胞凋亡的調(diào)控作用。從細胞學和分子生物學方面探討缺血性骨壞死的發(fā)病機制。 材料和方法: 1.實驗對象及處理因素 SD大鼠35只，雄性，體重280～300g(由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供)。2％戊巴比妥鈉25mg/kg腹腔注射麻醉，手術在無菌條件下進行，左側髖部為手術側，右側為對照側，切開左側關節(jié)囊，切斷股骨頭圓

4、韌節(jié)，使髖關節(jié)脫位，于大粗隆下20mm處截斷股骨，剝離軟組織，而后放置股骨近端于原位，縫合皮膚，不做內(nèi)外固定。分別于術后3h、6h、12h、24h、72h各處死7只，取出兩側股骨近端，4％多聚甲醛固定，20％EDTA(PH7.4)，4℃脫鈣2-3周，以針刺法檢查至脫鈣完全，而后石臘包埋。臨床收集21例股骨頸骨折需行人工關節(jié)置換術患者的股骨頭。病例均來自中國醫(yī)大一院骨科，男6例，女15例，年齡：62-83歲，取材時距骨折的時間3天-3周。

5、將股骨頭沿冠狀面剖開，切成厚約5mm骨片，4％多聚甲醛固定24h，20％EDTA(PH7.4)，4℃脫鈣3-4周，每3天更換脫鈣液，以針刺法檢查至脫鈣完全，而后石臘包埋。 2.試劑來源： 凋亡檢測試劑盒及兔抗大鼠Bc1-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體及生物素化抗地高辛抗體IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司。 3.觀察指標： ①HE染色；②透射電鏡觀察；③DNA凝膠電泳(瓊脂糖凝膠電泳分析DNA斷裂)；

6、④末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記[Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)dUTP nick end labeling，TUNEL]法檢測凋亡細胞；⑤免疫組化檢測Bcl-2、Bax表達；⑥計算機顯微圖像分析系統(tǒng)(型號：MetaMorph/DPl0/BX41，生產(chǎn)廠：UIC/OLYMPUS/US/JP)處理，x2檢驗和t檢驗，統(tǒng)計學分析。 結果: 1.動物實驗

7、部分HE染色形態(tài)學改變：缺血3h，6h骨小梁內(nèi)骨細胞及成骨細胞形態(tài)未見明顯改變，缺血12h：骨髓內(nèi)細胞可見變性壞死，部分骨細胞壞死，缺血24h：成骨細胞消失，缺血72h：可見軟骨細胞壞死。(2)透射電鏡：缺血12h及24h，細胞固縮，染色質(zhì)濃聚裂解，胞漿內(nèi)小泡及凋亡小體形成，細胞核可見邊集現(xiàn)象。(3)瓊脂糖凝膠電泳：本實驗缺血12h、24h標本提取DNA后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見到相同的“梯狀”條帶，梯狀條帶是凋亡細胞DNA片段化(f

8、ragmentation)的結果，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶(endonuclease)將核小體間的連接DNA降解，形成長度為180～200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，組蛋白和其它核內(nèi)蛋白質(zhì)不降解，核基質(zhì)也不改變，由于大部分細胞凋亡出現(xiàn)DNA梯狀條帶，而細胞壞死時DNA隨意斷裂為長度不一的片段，瓊脂凝糖膠電泳呈“彌散狀”(Smear)。本實驗中缺血72h即可見“彌散狀”條帶。(4)TUNEL陽性細胞(凋亡細胞)測定：缺血6h、12h、24h組均可檢

9、測到TUNEL陽性骨細胞，并與缺血3h、72h組對照，x2檢驗，有顯著性差異(p<0.01)。缺血3h可見Bcl-2及Bax陽性表達，缺血6h時Bcl-2/Bax增高，缺血12h，24h時Bcl-2/Bax下降，缺血72h時，Bcl-2及Bax均呈弱陽性表達。 2.臨床研究部分DNA凝膠電泳可見特征性“梯狀”(ladder)條帶，骨小梁骨細胞及骨髓細胞均有TUNEL檢測陽性細胞，統(tǒng)計學分析凋亡細胞與Bax表達,t檢驗有相關性(p