雙元載體pBCR1的構(gòu)建及胡蘿卜抗凍蛋白啟動子pafp的功能研究.pdf

1、RRD3是一段從水稻基因組中分離的在單子葉和雙子葉植物都具有較高活性的維管組織特異性強啟動子，本研究將其與雙元載體和細(xì)菌人工染色體結(jié)合，發(fā)展一種能轉(zhuǎn)化大片段DNA并能使目的基因在單子葉和雙子葉植物中高水平表達(dá)的通用型植物表達(dá)雙元載體pBCR1。構(gòu)建的pBCR1主要含有以下元件：1)來源于F因子復(fù)制起點和pVS1質(zhì)粒的rep和sta區(qū)段，控制質(zhì)粒在大腸桿菌與農(nóng)桿菌中穩(wěn)定復(fù)制，并帶有卡那霉素抗性基因作為細(xì)菌選擇標(biāo)記；2)帶有可切除的來源于p

2、UC19的復(fù)制起點ori，當(dāng)其存在時質(zhì)粒以松弛型復(fù)制，將其切除后質(zhì)粒才以嚴(yán)緊型復(fù)制而維持單拷貝；3)含有T-DNA邊界區(qū)，可通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)化植物；左邊界帶有一個潮霉素抗性基因作為植物選擇標(biāo)記，右邊界帶有g(shù)usA作為報告基因；4)多克隆位點上游帶有RRD3通用型啟動子，驅(qū)動基因在單子葉和雙子葉植物中表達(dá)。對pBCR1進(jìn)行初步的功能鑒定，已經(jīng)證明pBCR1能在E.coli和A.tumefaciens穩(wěn)定復(fù)制并攜帶外源DNA片段。pB

3、CR1作為高容量的植物表達(dá)載體的功能需要進(jìn)一步研究證明?！　暮}卜中分離了一段抗凍蛋白基因5’上游序列，已經(jīng)初步證明其在煙草中具有啟動子活性。為了驗證這個啟動子作為植物表達(dá)載體啟動子的應(yīng)用價值，我們對其表達(dá)活性、組織特異性和冷誘導(dǎo)性作了進(jìn)一步的研究。實驗結(jié)果證明我們所克隆的這段胡蘿卜抗凍蛋白基因啟動子pafp在煙草中不具有冷誘導(dǎo)性和組織特異性，其平均表達(dá)活性比35S約高4倍，是一個組成型表達(dá)的強啟動子，對植物表達(dá)載體的構(gòu)建具有較高的