佛波酯類化合物聯(lián)合抗白血病藥物對K562細胞的影響.pdf

1、研究背景與目的:
　　 白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。目前臨床上應(yīng)用的白血病治療的藥物很多,有一部分能夠顯著提高白血病的緩解率。但是由于嚴(yán)重的不良反應(yīng)、個體差異和耐藥性的產(chǎn)生,使大部分抗白血病藥物的療效很不理想。近年來,誘導(dǎo)分化劑的出現(xiàn)讓我們看到了新的希望,有一些藥物的療效得到了肯定,許多誘導(dǎo)分化劑只對一種或少數(shù)幾種類型的白血病敏感,在臨床的使用中受到了很大的限制。因此,開發(fā)能夠增加白血病療效、減少毒副反應(yīng)和耐藥性的新藥或聯(lián)合治療

2、方案成為目前最迫切的需要。
　　 本論文通過體外的方法觀察佛波酯類化合物(12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯,12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA和12-O-乙酰佛波醇-13-癸酰酯,12-O-acetylphorbol-13-decanoate,APD)聯(lián)合抗白血病藥物(抗代謝類的阿糖胞苷,Cytarabine,Ara-c和細胞因子類的重組人粒細胞集落刺激因子,recombina

3、nthuman granulocyte colony-stimulation factor,rhG-CSF)對K562細胞抑制增殖和誘導(dǎo)分化兩方面的影響,初步探討佛波酯類化合物對白血病細胞的作用機制,并為抗白血病新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。同時,尋找新的能夠提高慢性粒細胞白血病療效的藥物聯(lián)合治療方案,為白血病的治療提供新的途徑。
　　 研究方法
　　 1佛波酯類化合物聯(lián)合Ara-c對K562細胞作用的影響
　　 1.

4、1細胞培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)基在37℃,5％CO2飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),每3天傳代1次。
　　 1.2TPA、APD、Ara-c單用和合用的濃度效應(yīng)關(guān)系測定及細胞形態(tài)學(xué)的觀察MTT的方法檢測藥物單獨及聯(lián)合作用后細胞抑制率的變化,分別于各組培養(yǎng)24、48、72h后觀察細胞形態(tài)學(xué)的變化。
　　 1.3TPA或APD聯(lián)合Ara-c對細胞誘導(dǎo)分化作用的影響收集各組細胞,分成兩份,一份加入0.1％NBT重懸孵育后,染

5、色,鏡下觀察細胞分化陽性率。另一份加入抗人單克隆抗體CD15-FITC和抗人單克隆抗體CD14-PE避光孵育后,流式細胞儀檢測。
　　 2 TPA聯(lián)合rhG-CSF對K562細胞作用的影響
　　 2.1細胞培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)基在37℃,5％CO2飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),每3天傳代1次。
　　 2.2TPA聯(lián)合rhG-CSF對K562細胞增殖的影響及細胞形態(tài)學(xué)的觀察MTT的方法測定藥物單用和聯(lián)合作用

6、后的抑制率,繪制量效曲線,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。分別于各組培養(yǎng)24、48、72h后觀察細胞形態(tài)學(xué)的變化。
　　 2.3 TPA聯(lián)合rhG-CSF對K562細胞分化的影響 NBT還原試驗和流式細胞儀檢測細胞分化成熟比率。
　　 3統(tǒng)計分析結(jié)果采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)均用(x)±S表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多組間均值比較。P<0.05記為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果

7、：
　　 1佛波酯類化合物聯(lián)合Ara-c對K562細胞作用的影響
　　 1.1細胞形態(tài)學(xué)的影響 TPA作用72h后,細胞聚集、折光率降低、體積變大、向周圍伸出偽足,一部分細胞呈貼壁狀態(tài)生長。高倍觀察發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)出現(xiàn)許多小氣泡狀物質(zhì),類似網(wǎng)球拍狀。APD作用后,細胞形態(tài)變化與TPA類似。Ara-c作用72h后,表現(xiàn)為細胞體積變大、折光率降低、板底出現(xiàn)許多細胞碎片,高倍下觀察到明顯的細胞破裂溶解,并呈濃度依賴性,1.44μmol

8、·L-1以上濃度少量細胞伸出偽足,呈貼壁狀態(tài)生長。TPA或APD和Ara-c合用后,形態(tài)學(xué)變化均比單用組明顯。
　　 1.2 TPA、APD、Ara-c單用的濃度效應(yīng)關(guān)系測定TPA、APD、Ara-c單獨作用K562細胞72h后,TPA的IC50為1.20nmol·L-1,APD的IC50為91.69nmol·L-1,Ara-c的IC50為1.18μmol·L-1,均在較低的濃度就能夠?qū)562細胞產(chǎn)生較強的抑制增殖的作用。

9、r>　　 1.3 TPA或APD聯(lián)合Ara-c對細胞增殖抑制作用的影響 TPA能夠協(xié)同低濃度的Ara-c(0.36μmol·L-1、0.72μmol·L-1)對K562細胞的抑制增殖作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但對Ara-c1.44μmol·L-1和1.8μmol·L-1這兩個濃度對細胞的作用沒有影響。APD不能協(xié)同Ara-c對K562細胞增殖的抑制作用。
　　 1.4 TPA或APD聯(lián)合Ara-c對細胞誘導(dǎo)分化作

10、用的影響 TPA和APD單獨作用后能夠誘導(dǎo)K562細胞向單核巨噬方向分化；Ara=c不僅能夠誘導(dǎo)細胞向單核巨噬方向分化,還同時誘導(dǎo)向粒系方向分化。TPA能夠協(xié)同Ara-c0.36μmol·L-1對K562細胞向單核方向的誘導(dǎo)分化作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),但對其使細胞向粒系方向分化的作用沒有影響。對于相對高濃度的Ara-c(1.44μmol·L-1)的誘導(dǎo)分化作用也沒有影響。APD不能協(xié)同Ara-c對K562細胞的誘導(dǎo)分化

11、作用。
　　 2 TPA聯(lián)合rhG-CSF對K562細胞作用的影響
　　 2.1細胞形態(tài)學(xué)的影響 rhG-CSF各濃度單獨作用K562細胞后,細胞形態(tài)變化均不明顯。
　　 2.2 TPA、rhG-CSF單用的濃度效應(yīng)關(guān)系測定 rhG-CSF各濃度作用K562細胞72h后對細胞的增殖抑制作用不明顯。
　　 2.3 TPA聯(lián)合rhG-CSF對K562細胞增殖的影響 TPA聯(lián)合rhG-CSF對K562細胞的增殖

12、抑制沒有協(xié)同作用。
　　 2.4 TPA聯(lián)合rhG-CSF對K562細胞分化的影響 rhG-CSF作用后,能使K562細胞向粒系方向誘導(dǎo)分化,但作用較微弱。TPA聯(lián)合rhG-CSF對K562細胞的誘導(dǎo)分化沒有協(xié)同作用。
　　 結(jié)論：
　　 1 TPA、APD、Ara-c對K562細胞均有抑制增殖,誘導(dǎo)其向單核巨噬細胞方向分化的作用。
　　 2 TPA能夠協(xié)同Ara-c對K562細胞的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用