納米載銅硅酸鹽對(duì)水產(chǎn)病原菌的吸附、殺菌活性及其在羅非魚(yú)上的應(yīng)用效果與機(jī)理研究.pdf

1、長(zhǎng)期使用抗生素和抗菌藥物，造成諸如細(xì)菌抗藥性、耐藥基因轉(zhuǎn)移、水產(chǎn)品中藥物殘留等不良后果，直接或間接威脅人類健康，而且由于長(zhǎng)期濫用抗生素引起水環(huán)境污染，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境惡化，生態(tài)平衡失調(diào)。因此，開(kāi)創(chuàng)新的科研途徑，研發(fā)安全無(wú)公害的新型抗菌材料已迫在眉睫。 采用納米無(wú)機(jī)材料為載體，擔(dān)持抗菌金屬離子而制成的金屬系納米無(wú)機(jī)抗菌材料，具有穩(wěn)定性好、不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、作用持久，使用安全等優(yōu)點(diǎn)。層狀硅酸鹽材料MMT的結(jié)構(gòu)、化學(xué)鍵、類質(zhì)同像代替、

2、層間域與層電荷、陽(yáng)離子交換等本質(zhì)屬性決定了MMT的納米屬性。MMT納米屬性是納米化處理與加工的基礎(chǔ)。本課題以MMT為材料構(gòu)建納米硅酸鹽(Layer silicate Nanoparticle，LSN)；從水產(chǎn)病原菌電性、疏水性和細(xì)胞膜的特異性著手，對(duì)納米硅酸鹽進(jìn)行改性以提高其對(duì)水產(chǎn)病原菌的吸附選擇性；在此基礎(chǔ)上，在硅酸鹽納米材料上負(fù)載具有抑菌作用的銅，構(gòu)建了納米載銅硅酸鹽(Cu-loaded silicate Nanocomposite

3、,CSN)，并在以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究：(1)以LSN為對(duì)照，研究CSN的結(jié)構(gòu)；CSN的吸附、殺菌活性和機(jī)理：CSN對(duì)嗜水氣單胞菌粘附羅非魚(yú)上皮細(xì)胞的阻斷作用及其對(duì)嗜水氣單胞菌粘附引起魚(yú)上皮細(xì)胞膜損傷的影響；(2)以LSN、硫酸銅和黃霉素為對(duì)照，研究CSN對(duì)羅非魚(yú)的應(yīng)用效果和機(jī)理；(3)通過(guò)羅非魚(yú)養(yǎng)殖15天不換水試驗(yàn)，研究CSN對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)和菌群的影響。 主要研究結(jié)果如下： 1.CSN的平均粒徑為41nm。CSN所載銅主

4、要是以水合或復(fù)合陽(yáng)離子的形式，以 離子交換的方式進(jìn)入硅酸鹽晶格層間，還有少量銅以化學(xué)吸附的形式進(jìn)入Si-O 四面體和Al-O八面體的微孔中，所載銅可降低硅酸鹽所帶負(fù)電荷的密度，這 有助于CSN與細(xì)菌間的靜電吸附作用。與LSN相比，CSN的外比表面積、孔 體積和孔徑增大，而總比表面積、微孔比表面積、微孔體積則減小。 2.CSN的Zeta電位隨pH升高(pH值2～10)而增大，當(dāng)pH=4.8時(shí)，Zeta電位從 負(fù)值轉(zhuǎn)變?yōu)檎?/p>

5、值；LSN、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌的Zeta電 位隨pH升高而降低。當(dāng)pH=6時(shí)，材料和細(xì)菌的Zeta電位均隨離子強(qiáng)度的 增大而增大。 3．體外吸附試驗(yàn)表明：在pH為6.0、離子強(qiáng)度為0.01 mol／LNaNO<,3>的條件下， CSN在120 min左右達(dá)到吸附平衡，對(duì)嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單 胞菌的平衡吸附率分別為96.6％，94.4％，99.4％；而LSN在60 min左右達(dá)到 吸附平

6、衡，對(duì)嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌的平衡吸附率分別為 42.1％，37.4％，46.5％。pH和離子濃度對(duì)細(xì)菌吸附率影響的結(jié)果表明：CSN對(duì) 細(xì)菌的吸附率先隨pH的增加而減小，然后到pH=4.8時(shí)又逐漸增大，LSN對(duì) 細(xì)菌的吸附力隨著pH的增加而逐漸減??；LSN和CSN對(duì)細(xì)菌的吸附率均隨 著離子強(qiáng)度的增加而降低。 4．體外抗菌試驗(yàn)表明：CSN對(duì)嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌的最小 殺菌濃度分別為600

7、、600、300 mg／L，而LSN未顯抗菌活性。CSN對(duì)細(xì)菌胞 內(nèi)酶活性影響結(jié)果顯示，CSN可使細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生損傷或通透性增大，導(dǎo)致細(xì) 菌胞內(nèi)酶的外漏。CSN對(duì)細(xì)菌呼吸代謝影響的結(jié)果表明，CSN可抑制三羧酸循 環(huán)途徑。原子力顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察CSN作用下嗜水氣單胞茵形態(tài)變化的結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，CSN能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜而產(chǎn)生殺滅效果。 5．CSN對(duì)嗜水氣單胞菌粘附羅非魚(yú)上皮細(xì)胞影響的結(jié)果顯示：CSN顯著降低了嗜 水氣單胞菌對(duì)鰓、皮

8、膚和腸上皮細(xì)胞的粘附率；嗜水氣單胞茵粘附魚(yú)上皮細(xì)胞 后胞漿游離鈣、細(xì)胞膜磷脂酶A<,2>活性，細(xì)胞外LDH含量和細(xì)胞損傷率(膜通透 性)、腸上皮細(xì)胞膜熒光偏振度和膜脂微粘度(膜流動(dòng)性)顯著增加；CSN可顯著 降低由于嗜水氣單胞菌粘附魚(yú)上皮細(xì)胞引起的細(xì)胞膜損傷。 6．選取平均體重為3.9 g的健康尼羅羅非魚(yú)，飼喂含0.15％CSN的日糧56天，發(fā) 現(xiàn)CSN顯著提高了羅非魚(yú)的生長(zhǎng)性能和存活率。進(jìn)一步研究得知，CSN顯著 降

9、低腸道細(xì)菌數(shù)量，并明顯改變腸道菌群的組成，使氣單胞菌屬，假單胞菌屬， 黃桿菌屬，不動(dòng)桿菌屬，產(chǎn)堿菌屬，腸桿菌科，弧菌屬的百分比減少；顯著提 高白細(xì)胞吞噬活性、血清和體表粘液溶菌酶活性、紅細(xì)胞C<,3b>受體花環(huán)百分率； 顯著提高各腸段絨毛和微絨毛高度；顯著提高腸組織蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶 活性和飼料養(yǎng)分的表觀消化率。與黃霉素組相比，CSN組羅非魚(yú)日增重、特定 生長(zhǎng)率、腸組織淀粉酶和脂肪酶、中腸微絨毛高度顯著提高，在其他指標(biāo)上均

10、 具一定的優(yōu)勢(shì)，但差異不顯著。結(jié)果提示：CSN通過(guò)抑制腸道病原菌的增殖， 提高機(jī)體的非特異性免疫機(jī)能，改善腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，以益于消化酶的分泌和飼料養(yǎng)分的消化，從而提高羅非魚(yú)的生長(zhǎng)性能和存活率。7．選取平均體重為43.5g的健康尼羅羅非魚(yú)，飼喂含0.15％CSN的日糧15天， 試驗(yàn)期間不換水，發(fā)現(xiàn)CSN顯著提高了羅非魚(yú)的生長(zhǎng)性能和存活率；降低水 體氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和COD<,Mn>；使水體細(xì)菌數(shù)量顯著降低，并使水 體菌

11、群組成發(fā)生了變化，使氣單胞菌屬，假單胞菌屬，黃桿菌屬，產(chǎn)堿菌屬， 腸桿菌科的百分比減少。結(jié)果提示：CSN通過(guò)提高飼料利用效率，降低排入水 域環(huán)境的飼料比例，從而改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)；飼料在水體中溶出的CSN或者通過(guò)糞便從羅非魚(yú)體內(nèi)排出的CSN仍然具有較高的殺菌活性。 綜上所述，CSN的抗菌機(jī)理是基于納米硅酸鹽的吸附性能和Cu<'2+>的殺菌活性，更重要的是，CSN能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜而產(chǎn)生殺滅效果；CSN能有效抑制腸道病原菌的增殖，阻斷病