載菌納米級(jí)硅酸鹽微粒的構(gòu)建及其凈化養(yǎng)殖水質(zhì)的效果和機(jī)理探討.pdf

1、隨著高密度人工水產(chǎn)養(yǎng)殖快速發(fā)展，池塘水質(zhì)不斷惡化，直接或間接導(dǎo)致了水體的富營(yíng)養(yǎng)化、水產(chǎn)病害的頻繁發(fā)生以及水產(chǎn)品失去固有的鮮味等，這給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。與此同時(shí)，未經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水的任意排放，不僅帶來二次污染，而且還威脅到人類自身的健康和生存。鑒于此，本課題針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中這一特殊池塘水體的理化特性，以納米科技為平臺(tái)，結(jié)合微生態(tài)理論，開展集吸附、降解和轉(zhuǎn)化為一體的載菌納米級(jí)硅酸鹽微粒(PSPN)的構(gòu)

2、建及其凈化養(yǎng)殖水質(zhì)的機(jī)理探討。 主要包括以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：(1)采用AODC法定量分析了精養(yǎng)池塘懸浮顆粒附著細(xì)菌以及與懸浮顆粒、游離細(xì)菌和顆粒有機(jī)碳之間的關(guān)系，并計(jì)數(shù)了懸浮顆粒上的附著細(xì)菌數(shù)，為進(jìn)一步構(gòu)建PSPN提供了現(xiàn)實(shí)依據(jù)和模型；(2)結(jié)合國(guó)內(nèi)外凈化養(yǎng)殖水質(zhì)所采用的益生微生物，分離、篩選和鑒定了包括沼澤紅假單胞菌(Rp．palustris，編號(hào)為HZ0201)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans，編號(hào)為 HZ0202)和

3、啤酒酵母(S.cerevisiae，編號(hào)為HZ0203)在內(nèi)的益生菌株，并對(duì)它們的培養(yǎng)和生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究；(3)對(duì)篩選的益生菌株進(jìn)行了復(fù)合優(yōu)化組合和安全性試驗(yàn)研究；(4)制備納米級(jí)硅酸鹽附載材料(SCN)，并且以未處理的層狀硅酸鹽(OLS)為對(duì)照對(duì)SCN進(jìn)行了表征，比較研究了SCN的晶體結(jié)構(gòu)、表面特性和吸附性能；(5)針對(duì)養(yǎng)殖池塘水體的特殊理化性質(zhì)，利用制各的SCN和分離篩選的有益微生物，構(gòu)建了PSPN，并對(duì)構(gòu)建條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，此

4、外，探討了SCN與復(fù)合有益微生物的作用機(jī)理；(6)分離和原代培養(yǎng)了尼羅羅非魚(Oreochromis nilotica)鰓和腸道上皮細(xì)胞，并以其為細(xì)胞模型，研究了一定濃度的PSPN對(duì)上皮細(xì)胞增殖、存活率、通透性、胞漿游離Ca<'2+>和磷脂酶A<,2>活性的影響；(7)對(duì)構(gòu)建的PSPN凈化室內(nèi)和池塘養(yǎng)殖水質(zhì)的效果和機(jī)理進(jìn)行了探討。主要研究結(jié)果如下： 1．池塘懸浮顆粒附著細(xì)菌的研究結(jié)果顯示，附著細(xì)菌與附菌顆粒、未附菌顆粒和懸浮顆粒

5、之間呈顯著正相關(guān)，表明了在南美白對(duì)蝦池塘養(yǎng)殖水體中，附著細(xì)菌的數(shù)目主要取決于水體中懸浮顆粒的數(shù)目，而與顆粒有機(jī)碳的含量并沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)。被細(xì)菌附著的懸浮顆粒數(shù)量占總懸浮顆粒數(shù)量的比例約50％，而附著4個(gè)細(xì)菌以上的懸浮顆粒占總附菌顆粒的比例卻少于10％，說明顆粒物質(zhì)的表面積并非附著細(xì)菌的限制因素。南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水體附著細(xì)菌的數(shù)量均值為6.33×10<'4>個(gè)/ml，僅占細(xì)菌總數(shù)的1.76％。但相對(duì)于游離細(xì)菌，附著細(xì)菌

6、具有更大的代謝活力，主要表現(xiàn)在附著細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收速率快，而且具有較大的細(xì)胞體積。 2．分別分離和篩選了三種益生菌株，通過形態(tài)學(xué)、理化特性以及核酸特征測(cè)定，鑒定為沼澤紅假單胞菌菌株HZ0201、凝結(jié)芽孢桿菌菌株HZ0202和酵母菌菌株HZ0203。并分別研究了各自的生長(zhǎng)和培養(yǎng)特性，結(jié)果表明它們對(duì)生長(zhǎng)條件的要求不苛刻，具有廣泛的適應(yīng)性，適合于大量培養(yǎng)與在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用。 3．菌株的優(yōu)化組合試驗(yàn)結(jié)果表明，HZ0201、HZ

7、0202和HZ0203三種微生物之間均不存在相互拮抗，可以在復(fù)合培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)且生長(zhǎng)具有一定的共性。復(fù)合菌株的溶血性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血平板上均沒有透明圈形成，說明復(fù)合菌株沒有溶血性。復(fù)合菌株對(duì)仔蝦的安全性試驗(yàn)結(jié)果顯示，與添加無菌海水的組比較差異并不顯著，但與添加致病副溶血弧菌的組比較差異顯著(P<0.01)，說明篩選得到的三種菌株的復(fù)合培養(yǎng)物對(duì)于南美白對(duì)蝦沒有致病性。 4．基于層狀硅酸鹽特殊的結(jié)構(gòu)特征和納米屬性制備了SCN，X射線

8、衍射譜線表明為典型的鈣質(zhì)硅酸鹽。進(jìn)一步表征結(jié)果顯示，SCN無論從離子交換容量、BET比表面積、微孔表面積、外表面積還是孔體積、微孔體積上都要優(yōu)于OLS，具備納米材料的特性。對(duì)復(fù)合菌體胞內(nèi)酶活性的影響結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，SCN的添加對(duì)復(fù)合菌體胞內(nèi)酶乳酸脫氫酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性均沒有顯著的影響。這說明SCN不影響復(fù)合菌體細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的完整性，從一定程度上表明SCN對(duì)于復(fù)合菌體沒有毒害作用。 5．針對(duì)養(yǎng)殖

9、池塘水體的特殊理化性質(zhì)，構(gòu)建了PSPN，并分別研究了SCN附載菌數(shù)與SCN重量、復(fù)合菌液起始菌數(shù)和濃度以及菌液體積的關(guān)系，優(yōu)化了構(gòu)建條件。此外，通過測(cè)定不同粒徑的硅酸鹽材料，不同的pH值、離子強(qiáng)度和溫度條件下對(duì)復(fù)合菌體懸液的吸附率，探討SCN與有益復(fù)合菌體的作用機(jī)理。結(jié)果表明，隨著硅酸鹽粒徑的減少，對(duì)復(fù)合菌體的吸附能力明顯增加，吸附率從OLS的22.70％上升到SCN的90.20％，差異顯著(P<0.01)。SCN對(duì)復(fù)合菌體的吸附能力隨

10、著pH值的升高而逐漸降低，不同離子強(qiáng)度條件下，呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。不同溫度條件下，SCN對(duì)復(fù)合菌體的吸附率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為30℃時(shí)吸附率最高為89.74％。這說明復(fù)合菌體的吸附不僅依賴于生物體的生物化學(xué)屬性和表面屬性，也受到環(huán)境溫度等條件的影響。 6．PSPN對(duì)尼羅羅非魚上皮細(xì)胞的影響結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加適當(dāng)濃度的PSPN、復(fù)合菌株和SCN對(duì)細(xì)胞增殖、存活率、細(xì)胞通透性、胞漿游離Ca<'2+>和磷脂酶A<,2

11、>活性均有一定影響，但是差異不顯著。此外，觀察PSPN對(duì)尼羅羅非魚鰓和腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響，結(jié)果沒有出現(xiàn)任何異常形態(tài)。說明PSPN在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)尼羅羅非魚鰓和腸道上皮細(xì)胞沒有毒害作用。 7．模擬室外池塘養(yǎng)殖試驗(yàn)，對(duì)構(gòu)建的PSPN進(jìn)行了應(yīng)用效果和機(jī)理研究，結(jié)果表明PSPN不僅可以改善鯽魚養(yǎng)殖水質(zhì)，還能夠提高其生長(zhǎng)性能。與對(duì)照組相比，添加0.01g/L的PSPN可以顯著(P<0.01)降低氨氮、亞硝酸鹽氮、COD和硫化物的含量

12、，凈化了養(yǎng)殖水質(zhì)。同時(shí)，PSPN添加顯著提高了鯽魚的日增重和相對(duì)增重率(P<0.01)。這主要得益于組成其的附載材料和復(fù)合有益菌株的共同作用。 8．凈化甲魚養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的研究結(jié)果表明，添加PSPN可以顯著降低水體中氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽、硫化物和COD的濃度(P<0.05)，但是對(duì)pH值的影響不大(P>0.05)。凈化南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的研究結(jié)果顯示，添加PSPN不僅顯著改善了池塘水體的透明度和COD濃度(P<0.05)，

13、可溶性無機(jī)氮和可溶性正磷酸磷濃度上升的幅度也顯著小于對(duì)照組。池塘菌群含量也發(fā)生了變化，結(jié)果表明添加PSPN的試驗(yàn)組水體中芽孢桿菌、氨化細(xì)菌和蛋白質(zhì)礦化細(xì)菌的數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組水體中總菌的數(shù)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，但是弧菌的數(shù)量(4.37×10<'2>cfu/ml)要明顯低于對(duì)照組(2.09×10<'3>cfu/ml)。此外，添加PSPN的試驗(yàn)組，南美白對(duì)蝦具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。凈化南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底

14、質(zhì)的研究結(jié)果表明，PSPN的添加減緩了底質(zhì)中總氮、總磷、有機(jī)碳和硫化物的沉積，緩解了底質(zhì)惡化的趨勢(shì)，延緩了底質(zhì)的老化。此外，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組池塘底質(zhì)中擁有較高數(shù)量的芽孢桿菌、氨化細(xì)菌、硫氧化細(xì)菌和硫還原細(xì)菌等益生菌群。而養(yǎng)殖末期弧菌的數(shù)量卻明顯低于對(duì)照組(p<0.05)。這些與構(gòu)建PSPN的SCN和復(fù)合菌株在養(yǎng)殖池塘水體中的共同作用是分不開的。 綜上所述，PSPN有效地結(jié)合了納米硅酸鹽材料和復(fù)合微生物的優(yōu)勢(shì)，當(dāng)添加到養(yǎng)殖水體