宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩大鼠ghrelin和胰島素表達(dá)研究.pdf

1、代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)包括肥胖、血脂代謝異常、高血糖或胰島素抵抗、高血壓等相關(guān)臨床表型,是近年來國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn).其主要病理生理機(jī)制涉及腹型肥胖和胰島素抵抗(ilisalin resistance IR).目前流行病學(xué)和臨床研究已經(jīng)在不同國(guó)家、不同種族人群中證實(shí)了低出生體重(loW binll weightLBW)或?qū)m內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(intrauterine growth retardation IU

2、GR)與成人MS之間的相關(guān)性.研究者一直試圖解釋宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩與成人疾病相關(guān)性之間的機(jī)制,先后提出冠心病、糖尿病等成人疾病的"胎兒起源"假說(fetal originS of adult diseases)、"營(yíng)養(yǎng)程序化(nutritional programming)"和"代謝程序化(metabolic programming)"的概念,認(rèn)為生后早期對(duì)不利營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)可導(dǎo)致胰島內(nèi)分泌功能和結(jié)構(gòu)的改變及靶器官的敏感性下降,并可持續(xù)至成年

3、期,使2型糖尿病易患性增加.各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究也在不斷地探索宮內(nèi)或生后早期營(yíng)養(yǎng)不良導(dǎo)致以后發(fā)生MS的機(jī)制. 基于上述研究背景我們希望了解:1.胰島上ghrelin表達(dá)細(xì)胞的分布與α細(xì)胞、β細(xì)胞之間的關(guān)系.2.在宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良時(shí),胰島ghrelin的表達(dá)和ghrelin細(xì)胞的分布是否會(huì)改變?β細(xì)胞的減少是否伴隨曲ghrelin表達(dá)細(xì)胞數(shù)量的變化?3.生后不同的飲食干預(yù)是否會(huì)改變胰島ghrelin的表達(dá)規(guī)律? ghrelin是否在

4、宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩所致的胰島素抵抗進(jìn)程中發(fā)揮作用. 第一部分：宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩對(duì)新生大鼠ghrelin和胰島素表達(dá)的影響 目的：1. 建立宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良新生大鼠模型,比較分娩后母鼠以及出生后仔鼠血糖、胰島素和ghrelin水平;2. 比較不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)新生大鼠胰島ghrelm和胰島素mRNA、蛋白的表達(dá)水平.探討ghrelin主要由何種胰島細(xì)胞表達(dá). 方法： 1.宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良大鼠模型的建立和分組12周齡懷孕第2天的SD

5、孕鼠20只,隨機(jī)分配入自由進(jìn)食組(nourished rots;NR)和營(yíng)養(yǎng)限制組(undemourised rats, UR).懷孕第2天至23 d(分娩時(shí))NR組予標(biāo)準(zhǔn)孕鼠飼料喂養(yǎng),UR組僅予50﹪NR.組日進(jìn)食量.NR.組母鼠所生仔鼠為正常出生體重組(normal birth weight group NBW,n=79);UR組母鼠所生仔鼠為低出生體重組(low birth weight group LBW n=74).

6、2.實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè) 留取分娩后母鼠和出生后2h內(nèi)新生仔鼠的血標(biāo)本;收集新生仔鼠的胰腺標(biāo)本,取部分凍存于液氮中用于RT-PCR,部分用4﹪多聚甲醛固定用于免疫組化及激光共聚焦分析,部分用膠原酶消化后行胰島ghrelin和胰島素分泌量測(cè)定.測(cè)定血糖,ghrelin和胰島素水平測(cè)定采用放射免疫法.胰腺ghrelm抽提參照Toshinai et al的方法加以改良.采用完整胰腺靜止消化法以分離胰島,DTZ染色后在顯微鏡下手工挑選胰島,在葡

7、萄糖濃度為16.7 mmnol/L的條件下孵育90 min,隨后收集培養(yǎng)液,并測(cè)定其中胰島素含量.采用RT-PCR檢測(cè)ghrelin和胰島素mRNA水平的表達(dá).采用免疫熒光雙染、DAPI染色和共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)胰島ghrelin和胰島素陽性細(xì)胞數(shù). 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(10.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.資料分別用均數(shù)和95﹪可信區(qū)間(95﹪confidence intervals 95﹪CI)或中位數(shù)表示,

8、兩組間差異應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn),p<0.05認(rèn)為差異有顯著性意義. 結(jié)論： 1 宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良不僅影響仔鼠出生體重,還影響其血漿ghrelin和胰島素水平. 2 IUGR新生大鼠存在胰島ghrelin表達(dá)和ghrelin陽性細(xì)胞分布的改變. 第二部分 生后營(yíng)養(yǎng)對(duì)宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩大鼠胰島素和ghrelin 表達(dá)的影響 目的：1.分析生長(zhǎng)發(fā)育過程中宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩新生大鼠胰腺胰島素和ghrelin的表達(dá)變化:2.

9、探討飲食干預(yù)對(duì)LBW大鼠發(fā)生T2DM的病理生理進(jìn)程影響,了解ghrelin是否在該病理進(jìn)程中起作用. 方法： 1. 動(dòng)物模型的建立和分組宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的LBW大鼠模型建立同前,出生后仔鼠分組如下:1 NBw.常規(guī)飼料組(N-N-組)2 NBW-高脂高熱量飼料組(N-H-組)3 NBW-高蛋白飼料組(N-P-組)4 LBW-常規(guī)飼料組(L-N-組)5 LBW高脂高熱量飼料組(L-H-組)6 LBW高蛋白飼料組(L-P-組)

10、 2.標(biāo)本收集以上各組大鼠分別在3天、7天、10天、2周、3周、4周、8周、12周收集血漿標(biāo)本(n=10/組),1-3周仔鼠胰腺標(biāo)本的處理方法參照第一部,4、8和12周大鼠胰腺采用改良靜止消化法獲取胰島用于RT-PCR(n=10/組)、ghrelm含量測(cè)定(n=10/組)、胰島素分泌量測(cè)定(n=10/組)、胰腺免疫組化(n=5/組).其他方法和檢測(cè)指標(biāo)同第一部分. 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(10.0)

11、進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.各組數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間的比較采用One-wayANOVA檢驗(yàn),p<0.05差異有顯著性. 結(jié)論： 1.宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩對(duì)體重和血ghrelin水平、胰島素分泌的影響在生后持續(xù)存在. 2. 高脂高熱能飲食能夠誘發(fā)IUGR大鼠胰島素抵抗,加重胰島β細(xì)胞分泌缺陷;兩者均對(duì)宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良大鼠后期高血糖的易感性起作用. 3.高蛋白飲食能延緩或降低IUGR大鼠后期發(fā)生高血糖,胰島上延緩消失的g