聯(lián)合應用胰島素和硫酸軟骨素酶ABC對大鼠急性脊髓損傷修復作用的實驗研究.pdf

1、目的：探討聯(lián)合應用胰島素和硫酸軟骨素酶ABC對大鼠急性脊髓挫裂傷后脊髓再生修復的影響及可能機制。 方法：采用改良Allen's打擊法建立T9脊髓挫裂傷模型，將SD大鼠隨機分為6組：A（正常，n=4）組、B（損傷對照，n=24）組、C（ChABC，n=24）組、D（Ins，n=24）組、E（Ins+ChABC，n=24）組、F（MP，n=24）組，其中B、C、D、E、F組又分為傷后第1天，第3天，第7天，2周，4周，8周共6個亞組

2、，每個亞組4只。A組：不進行任何干預處理；B組：SCI后30min內(nèi)，腹腔注射生理鹽水1ml，以后每日腹腔注射生理鹽水1ml，連續(xù)1周：C、E組SCI后蛛網(wǎng)膜下腔放置PE-0402導管，C組SCI后30min內(nèi)，向?qū)Ч軆?nèi)注射ChABC6μl（1U/ml），再注射生理鹽水6μl，連續(xù)給藥7d；E組SCI后30min內(nèi)，向?qū)Ч軆?nèi)注射ChABC6μl（1U/ml），再注射生理鹽水6μl，連續(xù)給藥7d，同時在SCI后30min內(nèi)，經(jīng)腹腔注射普通

3、速效Ins1 IU/kg/d+50％葡萄糖1g/kg/d，分3次給藥，每8h1次，連續(xù)給藥7d；D組SCI后30min內(nèi)，經(jīng)腹腔注射普通速效Ins1IU/kg/d+50％葡萄糖1g/kg/d，分3次給藥，每8h1次，連續(xù)給藥7d；F組SCI后將16號留置針置入尾靜脈，SCI后30min內(nèi)，首次MP30mg/kg，作為沖擊量于15分鐘內(nèi)靜脈輸入，其配制濃度是25mg/ml注射水，間隔45分鐘，然后以5.4mg/kg/h，連續(xù)23小時靜脈滴

4、入。觀察指標和資料收集：1.運動功能觀察：各組大鼠于SCI后第1天、第3天、第7天、2周、4周、8周時行BBB評分測定。2.神經(jīng)電生理檢查：各組大鼠于SCI后第1天、第3天、第7天、2周、4周、8周時行脊髓感覺誘發(fā)電位和脊髓運動誘發(fā)電位檢測，記錄其潛伏期和波幅。3.取材：所有大鼠于神經(jīng)電生理檢查完畢后，取出包含損傷段的脊髓行固定，包埋。4.組織形態(tài)學觀察：將所有大鼠脊髓標本切片，行HE染色、Nissl染色、神經(jīng)細胞凋亡檢測、GAP-43

5、免疫組織化學檢測，并采用免疫組化圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。5.神經(jīng)束路示蹤：SCI后第7周時，每組大鼠（n=4）行BDA逆行示蹤，大鼠存活1周后，取脊髓標本行BDA染色顯影。所有數(shù)據(jù)行方差分析統(tǒng)計學比較。 結(jié)果：1.BBB評分：所有大鼠SCI前BBB評分均為21分，SCI后所有大鼠均出現(xiàn)了典型的截癱綜合征，BBB評分均為0分。傷后12h開始爬行，兩后肢呈拖行，足背著地。SCI后1天、3天時所有大鼠BBB評分均為0分，3天后各組大

6、鼠后肢運動功能開始恢復，SCI后1周，各組大鼠兩后肢仍拖行，足背著地，B組BBB評分2.00分，C組BBB評分2.50分，D組BBB評分3.75分，E組BBB評分4.00分，F(xiàn)組BBB評分3.25分，B組與C、D、E、F組間BBB評分有明顯統(tǒng)計學差異，P<0.05，C、D、E、F組間BBB評分無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05。SCI后2周，各組大鼠后肢活動均較有力，足掌可以著地，爬行活動較靈活，B組BBB評分7.75分，C組BBB評分8.

7、25分，D組BBB評分10.25分，E組BBB評分10.75分，F(xiàn)組BBB評分10.50分，D、E、F組間BBB評分無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；B、C組間BBB評分無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；B、C組與D、E、F組間BBB評分有明顯統(tǒng)計學差異，P<0.05。SCI后4周，各組大鼠均能用后肢負重站立，B組BBB評分12.00分，C組BBB評分12.50分，D組BBB評分13.25分，E組BBB評分14.50分，F(xiàn)組BBB評分14.

8、50分，B組與C、D、E、F組間BBB評分有明顯統(tǒng)計學差異，P<0.05。SCI后8周，各組大鼠均能在步行中持續(xù)性腳掌站立且持續(xù)性前后肢協(xié)調(diào)運動，B組BBB評分14.25分，C組BBB評分14.50分，D組BBB評分17.25分，E組BBB評分18.75分，F(xiàn)組BBB評分18.50分，E、F組間BBB評分無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；C、D組間BBB評分無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05：E、F組與C、D組間BBB評分有明顯統(tǒng)計學差異，P

9、<0.05。各組在不同時間點（SCI后第7天、2周、4周、8周時）BBB評分均有明顯統(tǒng)計學差異，P<0.05。 2.神經(jīng)電生理檢查：SCI后1天、3天、7天各組大鼠之間SCEP的峰潛伏期和波幅均無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；SCI后2周，D、E、F組大鼠SCEP的峰潛伏期和波幅較B、C組有明顯恢復，P<0.05，表現(xiàn)為峰潛伏期縮短，波幅增大，D、E、F組間大鼠SCEP的峰潛伏期和波幅均無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05，B、C組間

10、大鼠SCEP的峰潛伏期和波幅均無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；SCI后4周、8周，各組大鼠SCEP的潛伏期和波幅均無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05。SCI后1天、3天、7天各組大鼠MEP的潛伏期和波幅在損傷近端都不能測出，SCI后2周，D、E、F組大鼠脊髓損傷近端MEP的潛伏期和波幅開始恢復，而B、C組大鼠損傷近端記錄的MEP的潛伏期和波幅仍不能測出，D、E、F組較B、C組MEP的潛伏期和波幅有明顯差別，P<0.05；SCI后4、8周，各

11、組大鼠脊髓損傷近端記錄的MEP的潛伏期和波幅逐漸恢復，其中D、E、F組較B、C組有明顯恢復，P<0.05，而且D、E、F組每一時間段MEP潛伏期和波幅均比前一時間段有明顯恢復，P<0.05，表現(xiàn)為潛伏期縮短，波幅增大，D、E、F組間大鼠脊髓損傷近端記錄的MEP的潛伏期和波幅均無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05，B、C組間大鼠脊髓損傷近端記錄的MEP的潛伏期和波幅均無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05。在損傷遠端記錄到的MEP的潛伏期第1天、3天、

12、7天時B、C、D、E、F組間無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05。第2周時B、C組間無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；D、E、F組間無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；B、C組與D、E、F組間有明顯統(tǒng)計學差異，P<0.05。第4周時B、C、D、E、F組間無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05。第8周時B、C組間無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；D、E、F組間無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；B、C組與D、E、F組間有明顯統(tǒng)計學差異，P<0.05。在損傷遠端記錄

13、到的MEP的波幅在各個時間點均無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05。 3.組織形態(tài)學觀察：①HE染色及Nissl染色：SCI后1d、3d，可見脊髓彌漫性出血，灰質(zhì)內(nèi)出血重于白質(zhì)內(nèi)出血，D、E、F組較B、C組明顯為輕。尼氏體由正常的虎斑粗顆粒狀逐漸溶解淡染，B、C組病變較D、E、F組嚴重，神經(jīng)元腫脹明顯，胞漿呈空泡狀改變，著色神經(jīng)元數(shù)量減少。SCI后7天，脊髓仍出血，著色神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，損傷區(qū)組織出現(xiàn)大片壞死灶，壞死組織邊界不清楚，

14、炎性反應加劇，D、E、F組較B、C組為輕。SCI后2周，出血基本吸收，開始形成囊腔，脊髓損傷及周圍區(qū)炎性細胞浸潤減輕，尼氏體逐漸有所恢復，神經(jīng)元著色也逐漸加深。SCI后4、8周，損傷處形成囊腔，邊界清楚。②細胞凋亡：SCI后1天脊髓組織中即開始出現(xiàn)TUNEL陽性細胞，在灰質(zhì)和白質(zhì)中均有表達，3天時陽性細胞數(shù)較前明顯增多，在第7天時，陽性細胞表達達高峰，以后逐漸下降，在第4周時，陽性細胞已很少有表達，第8周時，基本上看不到陽性細胞。在SC

15、I后第1天、3天、7天、2周時，D、E、F組陽性細胞數(shù)明顯較B、C組為少，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05；D、E、F組間陽性細胞數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；B、C組間陽性細胞數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05。③GAP-43：SCI后第1天，GAP-43陽性細胞就開始出現(xiàn)，GAP-43陽性細胞主要在脊髓灰質(zhì)中，在白質(zhì)中也有少量表達，損傷后第7天陽性細胞數(shù)達到高峰，以后逐漸下降，尤其是B、C組下降迅速，到第4周時各組僅偶有陽性細胞的表

16、達。在第3天、7天、2周這三個時間點，D、E、F組較B、C組陽性細胞數(shù)多且著色深，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05；D、E、F組間陽性細胞數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05；B、C組間陽性細胞數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異，P>0.05。4.神經(jīng)束路示蹤：C、D、E、F組有再生神經(jīng)軸突通過囊腔，其中E組通過囊腔的神經(jīng)纖維數(shù)量較C、D、F組明顯為多，再生軸突長度也較長，而B組未見神經(jīng)纖維通過囊腔。 結(jié)論： 1：胰島素在神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育中

17、起重要作用，控制神經(jīng)元的形成、參與神經(jīng)元的生長、發(fā)育和分化、抑制神經(jīng)元凋亡、維持其存活和促進軸突出芽的作用。 2：其主要作用機制是胰島素與胰島素受體結(jié)合后可激活胰島素受體β亞單位的蛋白酪氨酸激酶，而后者通過作用于其下游的底物分子，引起信號轉(zhuǎn)導的級聯(lián)反應，從而啟動胰島素抗細胞凋亡的生物效應。途徑是經(jīng)IRS-1-Ras-MAPK和IRS-1-PI3K-PKB兩條途徑。 3：ChABC能特異性破壞CSPGs的葡胺聚糖鏈（GAG