硫酸軟骨素酶ABC對(duì)體外膠質(zhì)瘢痕模型治療作用的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)是人體神經(jīng)系統(tǒng)的最主體部分,包括腦和脊髓,其主要功能是傳遞、儲(chǔ)存和加工信息,產(chǎn)生各種心理活動(dòng),支配與控制人的全部行為。CNS損傷后,由于病變的神經(jīng)細(xì)胞不能有效地進(jìn)行再生修復(fù),而使其成為致死率、致殘率高居榜首的疾病之一。因此,CNS損傷的治療是醫(yī)學(xué)界的難點(diǎn),也一直是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。
　　 CNS損傷后,有多種抑制因素阻礙了軸突的再生,最終導(dǎo)致軸突再生失敗或局

2、部?jī)H形成有限的生長(zhǎng)。在損傷點(diǎn)周圍形成膠質(zhì)瘢痕,是CNS對(duì)損傷的一個(gè)重要的反應(yīng),并成為抑制軸突再生的一個(gè)重要抑制因素。瘢痕組織是由活化的星形膠細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞、激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、腦膜成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等組成；在膠質(zhì)瘢痕中包含了多種抑制軸突再生的抑制性分子,其中最重要的一種抑制分子是硫酸軟骨素蛋白多糖(Chondroitin sulphateproteoglycans,CSPGs)。有研究認(rèn)為,在CNS損傷后,有多

3、種類型的CSPG表達(dá)迅速提高,其不利于損傷的修復(fù),導(dǎo)致神經(jīng)軸突再生失敗。還有研究表明,CSPGs發(fā)揮抑制軸突再生的結(jié)構(gòu)是其氨基葡聚糖側(cè)鏈,通過(guò)硫酸軟骨素酶ABC(Chondroitinase ABC)消化其側(cè)鏈,具有減輕抑制軸突再生的能力。在ChABC用于治療CNS損傷的體內(nèi)研究中,發(fā)現(xiàn)了ChABC具有使部分神經(jīng)纖維再生、提高神經(jīng)的塑性和促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)的作用。但是到目前為止,ChABC的去膠質(zhì)瘢痕的機(jī)制還并不完全清楚,其發(fā)揮作用的最佳條件

4、亦無(wú)統(tǒng)一答案。
　　 為了從去膠質(zhì)瘢痕的角度促CNS損傷后的神經(jīng)再生,本研究通過(guò)用不同濃度的ChABC對(duì)體外膠質(zhì)瘢痕模型治療作用的初步探討,為后續(xù)深入研究在體CNS受損后的神經(jīng)再生提供去膠質(zhì)瘢痕方面的前期工作基礎(chǔ)。
　　 第一部分、皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)、純化及鑒定
　　 目的:獲取、傳代培養(yǎng)及初步鑒定大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦膜成纖維細(xì)胞,為下一步建立體外膠質(zhì)瘢痕模型及其治療研究奠定基礎(chǔ)。

5、r>　　 方法:
　　 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)、純化、傳代及成熟化培養(yǎng)。
　　 1.1 混合膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng):取新生1～3天Wistar大鼠2只,75％酒精浸泡3～5分鐘,斷頭處死,完整取下大腦,D-Hanks液沖洗3遍；分離大腦皮層,用顯微鑷仔細(xì)剝離腦膜和血管,再以D-Hanks液沖洗3遍；置青霉素小瓶中剪成≤1mm3大小的組織碎塊,以0.125％胰酶5ml在室溫條件下消化10～15分鐘,加用含10％胎牛血清的D

6、MEM/F12培養(yǎng)基5ml混勻終止消化;用火焰拋光的玻璃吸管輕輕吹打,直至無(wú)明顯組織塊；1000rpm、20℃離心5分鐘,棄上清；用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸,計(jì)數(shù)活細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml,接種至含有10％胎牛血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基的75cm2培養(yǎng)瓶中,置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),3天后全量換液一次,去除死細(xì)胞碎片；每2～3天半量換液一次,促混合膠質(zhì)細(xì)胞充分生長(zhǎng),形成細(xì)胞分層。
　　

7、 1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化及傳代:混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)至第9天全量換液,第10天用完全培養(yǎng)基輕輕沖洗三遍,以去除漂浮的、貼壁疏松的細(xì)胞,加10ml新鮮完全培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱平衡CO2氣體2小時(shí)；然后取出培養(yǎng)瓶,旋緊瓶蓋,固定在恒溫?fù)u床上37℃,250rpm,振搖15～18個(gè)小時(shí)；然后取下培養(yǎng)瓶,于細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)內(nèi)以75％酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面消毒；于操作臺(tái)上吸取原培養(yǎng)液輕輕吹打底層細(xì)胞三遍,再用新鮮培養(yǎng)基沖洗三遍,剩余的底層細(xì)胞主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞和

8、極少數(shù)的少突膠質(zhì)細(xì)胞；用0.25％胰酶-EDTA消化,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,細(xì)胞變圓后吸管輕輕吹打下貼壁細(xì)胞,收集細(xì)胞,1000rpm離心,新鮮完全培養(yǎng)基重懸,按1:3的比例傳代,傳代后神經(jīng)元受損死亡,此時(shí)細(xì)胞的主體是星形膠質(zhì)細(xì)胞,還有極少數(shù)的少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞。由于星形膠質(zhì)細(xì)胞分裂相對(duì)于少突膠質(zhì)細(xì)胞迅速,少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例迅速下降,此時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)抗GFAP免疫熒光鑒定,純度可達(dá)95％以上(詳見(jiàn)結(jié)果)。
　　 1.3 星形膠

9、質(zhì)細(xì)胞的成熟化培養(yǎng)。體外長(zhǎng)期培養(yǎng)(大于4周),大部分的細(xì)胞增殖緩慢,成為高分化成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞,用CCK8法測(cè)定1代和5代星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性,進(jìn)行對(duì)比。
　　 2.腦膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代。
　　 取新生1～3天Wistar大鼠2只,75％酒精浸泡3～5分鐘,斷頭處死,完整取下大腦,D—Hanks液沖洗3遍；分離大腦皮層,用顯微鑷仔細(xì)剝離腦膜,將后者收集于青霉素小瓶中,冷D—Hanks液沖洗三遍后,用眼科剪充分

10、剪碎,并將剪碎的腦膜組織塊接種至0.01％多聚右旋賴氨酸(Poly—D-lysine hydrobromide,PDL)包被的25cm2一次性培養(yǎng)瓶中,加含有10％胎牛血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基5ml,置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每周換液3次,腦膜成纖維細(xì)胞長(zhǎng)至融合后,按1:3傳代培養(yǎng),取2～5代的腦膜成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。
　　 3.陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)數(shù)方法星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)和腦膜成纖維細(xì)胞(Fibronectin)

11、進(jìn)行免疫熒光染色,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)數(shù)方法:選取3個(gè)樣本,每個(gè)樣本隨機(jī)取5個(gè)不重疊視野(200×),利用Image-Pro Plus6.0(IPP)彩色圖文分析軟件分別計(jì)算GFAP、Fibronectin陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù),和總細(xì)胞數(shù)(總細(xì)胞核數(shù)),計(jì)數(shù)計(jì)算免疫熒光染色陽(yáng)性率,以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。
　　 結(jié)果：
　　 1.混合膠質(zhì)細(xì)胞接種4h后,大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁；培養(yǎng)4天后,細(xì)胞長(zhǎng)至80％融合；培養(yǎng)至第9天,細(xì)

12、胞分層形成,底層上形成星形膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層；中層為少突膠質(zhì)細(xì)胞層；上層為小膠質(zhì)細(xì)胞。純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞活力好,5～7天可傳代。經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定,IPP圖像分析檢測(cè),星形膠質(zhì)細(xì)胞純度為:95.9％±1.3％。
　　 2.腦膜組織塊接種至PDL包被的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶后,1h內(nèi)完全貼壁；1天后,組織塊變得扁平,邊緣圓潤(rùn),并有少許腦膜成纖維細(xì)胞從組織塊生長(zhǎng)出；5天后腦膜成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶。體外培養(yǎng)的腦膜成纖維細(xì)胞胞體較小、

13、扁平、多呈梭形部分呈三角形和不規(guī)則形、折光性差、細(xì)胞生長(zhǎng)快,呈火焰狀生長(zhǎng)。經(jīng)抗Fibronectin免疫熒光鑒定,Image-pro plus(IPP)圖像分析檢測(cè),腦膜成纖維細(xì)胞的純度為:98.5％±0.6％。
　　 討論及結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)獲得了高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)>4周后,得到了高分化星形膠質(zhì)細(xì)胞；腦膜成纖維細(xì)胞體外增殖快,純度高,活力好?？梢杂糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分、膠質(zhì)瘢痕體外模型的制作及鑒定

14、>　　 目的:探討體外膠質(zhì)瘢痕的制作方法,為下一步的治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)組,(1)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)照組(A-Ctrl)；(2)星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械劃傷組(A-Scr):(3)星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組(A+F)；(4)星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)合機(jī)械劃傷組(A+F-Scr)。通過(guò)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械劃傷和腦膜成纖維細(xì)胞兩種刺激,來(lái)模擬CNS損傷后的膠質(zhì)反應(yīng)；并通過(guò)觀察各實(shí)驗(yàn)組星形膠質(zhì)

15、細(xì)胞在形態(tài)學(xué),GFAP、CSPGs蛋白表達(dá)上的變化,進(jìn)而確定體外膠質(zhì)瘢痕的制作方法。
　　 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng):星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)分化成熟后,以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105個(gè)/ml,每孔4.0×105個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞,接種于PDL包被的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每周換液3次,培養(yǎng)5～7天,待細(xì)胞胞突連接成網(wǎng)絡(luò)狀,即取腦膜成纖維細(xì)胞用于共培養(yǎng),每孔接種5.0×10

16、4個(gè)腦膜成纖維細(xì)胞,置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行共培養(yǎng),每周換液3次。分別于共培養(yǎng)1d,2d,3d并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、免疫熒光學(xué)觀察,星形膠質(zhì)細(xì)胞以GFAP(紅色熒光)標(biāo)記,腦膜成纖維細(xì)胞以Fibronectin(綠色熒光)標(biāo)記。
　　 2.機(jī)械劃傷:待星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)2天后,在超凈工作臺(tái)內(nèi),用10μL的微量移液器塑料吸嘴,在12孔板內(nèi)進(jìn)行“?！弊謽觿潅?使損傷程度和范圍基本保持一致。損傷后,D-Hanks液沖

17、洗三遍,然后加入完全培養(yǎng)基,置CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于損傷后0、24 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及免疫熒光鑒定。
　　 3.結(jié)果分析
　　 對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的膠質(zhì)瘢痕模型標(biāo)志物GFAP、CSPGs的特異性表達(dá),進(jìn)行免疫熒光染色。免疫熒光染色圖片,則用IPP免疫熒光強(qiáng)度分析法進(jìn)行評(píng)估,免疫熒光強(qiáng)度用平均光密度值表示,并進(jìn)行各組GFAP、CSPGs免疫熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦膜成纖

18、維細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)比較了正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)1天、2天、3天的模型。發(fā)現(xiàn)腦膜成纖維細(xì)胞具有明顯的促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和GFAP的表達(dá)作用。A-Ctrol組,星形膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟、胞突豐富,免疫熒光顯示:GFAP主要表達(dá)在核周圍的細(xì)胞骨架上；A+F組共培養(yǎng)1天后,星形膠質(zhì)細(xì)胞增長(zhǎng)的胞突向腦膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),并將其包圍,且與腦膜成纖維細(xì)胞接觸的胞突,GFAP染色熒光更明亮；共培養(yǎng)2天后,腦膜成纖維細(xì)胞周

19、圍形成星形膠質(zhì)細(xì)胞活化點(diǎn),GFAP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性；共培養(yǎng)3天后,活化點(diǎn)更明顯,大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集到腦膜細(xì)胞周圍,伸長(zhǎng)的胞突長(zhǎng)入腦膜成纖維細(xì)胞集落區(qū),與腦膜成纖維細(xì)胞緊密地長(zhǎng)在一起,形成瘢痕樣結(jié)構(gòu),GFAP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性。
　　 2.機(jī)械劃傷后,A-Scr組、A+F-Scr組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞突迅速向劃痕中央生長(zhǎng),4小時(shí)即可觀察到胞突生長(zhǎng)；24小時(shí)后劃痕兩側(cè)的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞突有少部分接觸,且在劃痕中央可以見(jiàn)到遷移的星形膠質(zhì)細(xì)胞；免疫熒

20、光染色顯示:劃痕兩側(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞突粗大、GFAP表達(dá)增強(qiáng),在A+F-Scr組劃痕處的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)亦強(qiáng)于遠(yuǎn)離劃痕處的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 3.膠質(zhì)瘢痕模型鑒定結(jié)果:
　　 A-Ctrl組:GFAP熒光染色均勻但較弱,平均光密度值為0.1746±0.0039；CSPGs熒光微弱,平均光密度值為0.0075±0.0007。
　　 A—Scr組:劃痕邊緣星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP熒光明顯增強(qiáng),平均光密度值為0.

21、2554±0.0061；CSPGs主要表達(dá)于劃痕邊緣,熒光也較對(duì)照組增強(qiáng),平均光密度值為0.0111±0.0007；
　　 A+F組:GFAP的熒光強(qiáng)度和A-Scr組相似,但分布較均勻,在與腦膜成纖維細(xì)胞交界處,GFAP熒光更強(qiáng),平均光密度值為0.4645±0.0049;CSPGs的熒光強(qiáng)度也明顯較正常星形膠質(zhì)組和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷組的強(qiáng),主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體上,胞核未見(jiàn)熒光染色,平均光密度值為0.0398±0.0008

22、。
　　 A+F-Scr組:具有A-Scr組和A+F組共有的特征,其GFAP平均光密度值為0.5042±4:0.0051,CSPGs平均光密度值為0.0410±0.0006。
　　 統(tǒng)計(jì)分析顯示各膠質(zhì)瘢痕模型組間GFAP的熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15020.345,P<0.05):CSPGs的熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9878.761,P<0.05)。
　　 討論及結(jié)論:機(jī)械劃痕及腦膜成纖維細(xì)胞這兩種刺

23、激因素均對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞起有激活作用,其中以腦膜成纖維細(xì)胞對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的刺激作用更強(qiáng)；星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)合機(jī)械劃傷,是制作體外膠質(zhì)瘢痕模型的有效方法。
　　 第三部分、ChABC去膠質(zhì)瘢痕體外實(shí)驗(yàn)的初步研究
　　 目的:研究不同濃度的ChABC對(duì)體外膠質(zhì)瘢痕模型的治療作用,初步探索去膠質(zhì)瘢痕的有效方法和條件。
　　 方法:將實(shí)驗(yàn)分為四組:膠質(zhì)瘢痕模型未治療組(untreated control

24、group)、1μU/mlChABC治療組、2.5μU/mlChABC治療組、5μU/mlChABC治療組。采用星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦膜成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)合機(jī)械劃傷方法制成體外膠質(zhì)瘢痕模型,并對(duì)膠質(zhì)瘢痕模型進(jìn)行編號(hào),將不同濃度的ChABC依分組條件加入到對(duì)應(yīng)的膠質(zhì)瘢痕模型中；作用24小時(shí)后,利用免疫熒光技術(shù)觀察三種不同濃度的ChABC對(duì)體外膠質(zhì)瘢痕模型中的GFAP和CSPGs蛋白表達(dá)的影響。值得一提的是,由于新近有觀點(diǎn)認(rèn)為ChABC能專一地降

25、解CSPGs的側(cè)鏈,使其喪失抑制神經(jīng)軸突再生的特性；小鼠抗CSPG抗體(Sigma,克隆區(qū)CS-56)能夠識(shí)別完整的CSPGs,而經(jīng)ChABC降解后的CSPGs,則無(wú)法由CS-56識(shí)別,因而可以將CSPGs用于觀察ChABC對(duì)體外膠質(zhì)瘢痕模型的治療效果。有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,對(duì)每個(gè)蛋白(包括GFAP和CSPGs)、每個(gè)分組選擇三個(gè)孔,每個(gè)孔隨機(jī)拍攝5張圖片,利用Image-Pro Plus6.0彩色圖文分析軟件,測(cè)量圖像的免疫熒光強(qiáng)度。免疫

26、熒光強(qiáng)度用平均光密度值表示,平均光密度值=IODsum/Area。用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±SD)”表示,比較采用t檢驗(yàn)或One-way ANOVA方差分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:膠質(zhì)瘢痕模型經(jīng)不同濃度的ChABC處理后,GFAP免疫熒光無(wú)明顯變化,熒光明亮；CSPGs免疫熒光經(jīng)由低到高濃度ChABC治療后,熒光強(qiáng)度逐漸減弱,1μ/mlChABC治療組熒光稍

27、減弱,2.5μU/mlChABC治療組熒光顯著減弱,5μU/mlChABC治療組幾乎見(jiàn)不到熒光。各組的GFAP、CSPGs免疫熒光強(qiáng)度用平均光密度值表示如下:(1)膠質(zhì)瘢痕模型未治療組:GFAP平均光密度值為0.5061±0.0086；CSPGs平均光密度值為0.0416±0.0031。(2)1μU/mlChABC治療組:GFAP平均光密度值為0.5101±0.0071；CSPGs平均光密度值為0.0350±0.0022。(3)2.5μ

28、U/mlChABC治療組:GFAP平均光密度值為0.5082±0.0097；CSPGs平均光密度值為0.0095±0.0018。(4)5μU/mlChABC治療組:GFAP平均光密度值為0.5039±0.0087；CSPGs平均光密度值為0.0003±00003。
　　 各組間GFAP熒光強(qiáng)度未見(jiàn)顯著變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.463,P>0.05)；CSPGs的熒光強(qiáng)度隨ChABC治療濃度的增大,逐漸減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意