人胚胎培養(yǎng)液氨基酸濃度和拉曼光譜特征與IVF-ET結(jié)局的關(guān)系.pdf

1、自首例試管嬰兒誕生以來，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization andembryo transfer,IVF-ET)技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，妊娠率也有了很大提高，然而胚胎種植率卻仍徘徊在10％～30％左右。影響胚胎種植的因素是多方面的，而胚胎的質(zhì)量是影響胚胎種植最重要的因素之一。目前，對(duì)胚胎質(zhì)量的評(píng)估主要是通過形態(tài)學(xué)方法，這種方法雖能在一定程度上反映胚胎的發(fā)育潛能，但仍缺乏足夠的準(zhǔn)確性并有一定的主觀性。為彌補(bǔ)其不

2、足，臨床工作中常需行多個(gè)胚胎移植，后者引起IVF-ET中多胎妊娠率明顯高于自然妊娠，眾所周知，多胎妊娠可致產(chǎn)科并發(fā)癥增加、患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重。因此，探討一種客觀、無創(chuàng)的胚胎活力評(píng)估方法，提高胚胎活力評(píng)估的準(zhǔn)確性，對(duì)于提高IVF-ET妊娠率、降低多胎妊娠率及減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等具有相當(dāng)重要的意義。
　　 隨著胚胎培養(yǎng)體系的發(fā)展，學(xué)者們開始研究胚胎代謝與胚胎發(fā)育潛能之間的關(guān)系。一些研究提示，培養(yǎng)液中諸如葡萄糖、丙酮酸等代謝物的濃度與胚

3、胎活力有關(guān)。然而，由于檢測(cè)費(fèi)用昂貴、技術(shù)復(fù)雜及耗時(shí)長(zhǎng)等原因，這些技術(shù)未能得到臨床應(yīng)用。21世紀(jì)初，有研究發(fā)現(xiàn)胚胎的氨基酸代謝水平與其發(fā)育潛能有關(guān)，并且氨基酸檢測(cè)技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷，測(cè)定胚胎氨基酸代謝水平可能成為評(píng)價(jià)胚胎活力的輔助方法。近年來，光譜技術(shù)由于快速、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中拉曼光譜因其受水信號(hào)影響小的特點(diǎn)更適用于液體樣品的分析。有研究發(fā)現(xiàn)胚胎培養(yǎng)液的拉曼光譜特征與胚胎的種植結(jié)局相關(guān)，然而，目前相關(guān)的研究主要側(cè)重于對(duì)

4、卵裂早期胚胎的評(píng)估，受精后第3-5天隨著胚胎基因組的激活，胚胎改造環(huán)境的能力增強(qiáng)，檢測(cè)此期胚胎的代謝水平可能更能反映胚胎的發(fā)育潛能，有可能提高評(píng)估的準(zhǔn)確性。此外，在不同的培養(yǎng)條件下，胚胎的代謝情況亦可能存在差異。
　　 本研究使用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)人類體外受精的胚胎培養(yǎng)后培養(yǎng)液的氨基酸濃度，同時(shí)采用拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液的拉曼光譜特征，分析胚胎受精后第5天培養(yǎng)液中氨基酸的濃度、胚胎受精后第3天和第5天培養(yǎng)液的拉曼光譜特征與IV

5、F-ET結(jié)局的關(guān)系，間接評(píng)估胚胎代謝與胚胎活力的關(guān)系，以期為探討客觀、無創(chuàng)的胚胎活力評(píng)估方法提供新的證據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1.研究對(duì)象
　　 收集2009年4月至2009年11月于中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院行IVF助孕的不孕夫婦，在患者知情同意的前提下，以其體外培養(yǎng)的胚胎及培養(yǎng)液為研究對(duì)象，共納入受精后第3天(D3)行胚胎移植的50例患者的99個(gè)胚胎和受精后第5天(D5)行胚胎移植的30例患者的60個(gè)胚胎。

6、
　　 2.標(biāo)本收集及保存
　　 胚胎移出后，D3移植的胚胎收集其卵裂液，D5移植的胚胎分別收集其卵裂液和囊胚培養(yǎng)液，-80℃冰箱保存，待測(cè)。@23.標(biāo)本檢測(cè)
　　 檢測(cè)日，標(biāo)本于25℃解凍后，卵裂液行拉曼光譜分析，囊胚培養(yǎng)液取10μl行高效液相色譜測(cè)定20種游離氨基酸的濃度，余下行拉曼光譜分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.患者基本情況分析
　　 妊娠組與未妊娠組比較，女方年齡、基礎(chǔ)FSH、

7、體重指數(shù)、周期數(shù)等均無顯著性差異(P均＞0.05)。
　　 2.囊胚培養(yǎng)液氨基酸濃度分析
　　 (1)D5胚胎移植，妊娠患者與未妊娠患者的囊胚培養(yǎng)液中谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸的濃度均較空白對(duì)照培養(yǎng)液明顯升高，而丙氨酰-谷氨酰胺的濃度則均較空白對(duì)照培養(yǎng)液明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)
　　 (2)D5胚胎移植，妊娠組胚胎的囊胚培養(yǎng)液中谷氨酰胺和丙氨酸的濃度均明顯低于未妊娠組(谷氨酰胺濃度的中位數(shù)分別為

8、60.8和84.7μmol/L，丙氨酸濃度的中位數(shù)分別為61.9和92.3μmol/L)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.029和0.023)。
　　 (3)單因素logistic回歸分析顯示，囊胚培養(yǎng)液中谷氨酰胺、丙氨酸的濃度、D5胚胎分級(jí)與妊娠呈負(fù)相關(guān)(相對(duì)危險(xiǎn)度[OR]分別為0.99、0.99和0.45，P分別為0.032、0.025和0.027)；色氨酸的濃度與妊娠呈正相關(guān)(OR=1.19，P=0.044)。多因素回歸分

9、析在校正D3細(xì)胞數(shù)、D3胚胎分級(jí)和D5胚胎分級(jí)的影響后，谷氨酰胺和丙氨酸的濃度仍然與妊娠呈負(fù)相關(guān)(OR分別為0.99和0.98，P分別為0.024和0.019)。
　　 3.胚胎培養(yǎng)液拉曼光譜分析
　　 (1)D3胚胎移植，妊娠組卵裂液拉曼光譜在拉曼位移2828.94-2823.85cm-1、2814.91-2804.69cm-1、2712.07-2706.89cm-1等19處的信號(hào)較未妊娠組明顯增強(qiáng)，而在3037.51

10、-3030.07cm-1、3016.42-2966.56cm-1、2961.55-2933.97cm-1等27處的信號(hào)則較未妊娠組明顯減弱(P均＜0.05)。ROC曲線分析，D3胚胎分級(jí)預(yù)測(cè)種植的靈敏度為52.1％，特異度為87.5％，曲線下面積為0.713；結(jié)合拉曼光譜特征和D3胚胎分級(jí)預(yù)測(cè)種植的靈敏度為87.5％，特異度為64.6％，曲線下面積為0.834。
　　 (2)D5胚胎移植，妊娠組卵裂液拉曼光譜在拉曼位移3023.

11、59-3008.68cm-1、2645.46-2628.47 cm-1、2602.24-2587.78 cm-1等14處的信號(hào)較未妊娠組明顯增強(qiáng)，而在2864.26-2842.66cm-1、2694.93-2691.04cm-1等19處的信號(hào)較未妊娠組明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。
　　 (3)D5胚胎移植，妊娠組囊胚培養(yǎng)液中拉曼信號(hào)明顯強(qiáng)于未妊娠組的位移段有1166.25-1177.24cm-1、1351.27

12、-1363.56cm-1、1414.07-1424.75cm-1、1625.01-1627.98cm-1、1839.32-1843.66cm-1、2711.71-2719.47cm-1，信號(hào)明顯弱于未妊娠組的位移區(qū)段有981.89-985.11cm-1、2266.53-2254.17cm-1(P均＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.囊胚培養(yǎng)液中部分氨基酸的濃度與體外受精-胚胎移植后能否妊娠有關(guān)，提示囊胚培養(yǎng)液中部分氨