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文檔簡介
1、背景和目的:
卵巢癌患者的外周血中也檢測出Annexin A3蛋白的表達,充分證實Annexin A3是一個可分泌蛋白。
本研究旨在前期工作的基礎(chǔ)上探討利用ELISA法在外周血定量檢測AnnexinA3蛋白的可行性。分析Annexin A3蛋白在正常婦女、卵巢良性腫瘤患者及卵巢癌患者外周血中的分布及表達水平,并初步探討卵巢癌患者外周血表達水平與卵巢癌鉑類耐藥的相關(guān)性。
方法:
1.
2、研究對象:連續(xù)入選于2009年12月至2010年2月期間在北京協(xié)和醫(yī)院體檢及就診的健康婦女、卵巢良性腫瘤和卵巢癌患者。
健康婦女入選標(biāo)準(zhǔn):納入婦科體格檢查、宮頸細胞學(xué)檢查及婦科超聲檢查均無異常,并同時進行了血清CA125檢測的婦女,排除既往有卵巢腫瘤或婦科及全身惡性腫瘤的婦女。年齡與卵巢癌患者匹配。
卵巢良性腫瘤入選標(biāo)準(zhǔn):在北京協(xié)和醫(yī)院住院手術(shù)治療的患者,病理診斷明確,術(shù)前進行了血清CA125檢測。
3、 卵巢癌患者入選標(biāo)準(zhǔn):在北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科治療及隨診,病理診斷為卵巢原發(fā)上皮癌,進行了血清CA125的檢測,排除合并其它婦科或全身惡性腫瘤的患者。卵巢癌耐藥病例包括耐藥性和難治性卵巢癌。耐藥性卵巢癌為,初次化療有效,但?;?個月以內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)。難治性卵巢癌為,初次化療時疾病進展或持續(xù)存在。將二者作為鉑耐藥性卵巢癌。
2.標(biāo)本及臨床資料收集:全部標(biāo)本來自北京協(xié)和醫(yī)院進行血清CA125檢測的剩余血清,檢測后于4℃冷庫內(nèi)保存
4、。7天之內(nèi)將血清樣本分裝到0.5mL Eppendorf中,轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存。在測量前判、時一次化凍。詳細記錄同一樣本的血清CA125水平以及所有對象相應(yīng)的臨床資料。
3.采用ELISA方法檢測上述樣本外周血清Annexin A3的濃度。每份樣本設(shè)3個復(fù)孔,取均值求得測定值。對于檢測過程的質(zhì)量控制措施包括:制定標(biāo)準(zhǔn)的操作程序,培訓(xùn)操作人員,一次性完成測定,在臨床檢驗專家的指導(dǎo)下設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線,隨機插入已知蛋白濃
5、度的質(zhì)控品,被檢樣品的隨機上樣,以及采用雙波長測定吸收值等。
4.采用回顧性分析的方法,分層分析臨床卵巢上皮癌化療敏感和耐藥病例的各生物學(xué)變量與Annexin A3蛋白表達水平的相關(guān)性;分析卵巢上皮癌患者的無鉑化療間期與Annexin A3蛋白表達水平的相關(guān)性。
5.采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。利用Crubbs氏法對ELISA測定進行質(zhì)控檢驗。Kolmogorov-Smirnov非參數(shù)檢驗進行質(zhì)控
6、品光密度及樣本的正態(tài)性檢驗。兩組正態(tài)分布獨立樣本比較采用t檢驗。兩組非正態(tài)分布獨立樣本比較利用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗。多組非正態(tài)分布獨立樣本比較利用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗。
研究結(jié)果:
1.連續(xù)收集病例共計271例。其中,健康婦女102例,年齡范圍31-78歲,中位年齡52歲。卵巢良性腫瘤患者47例,年齡范圍17-61歲,中位年齡36歲。卵巢癌患者122例,包括化療敏感病人63例,
7、耐藥病人59例;年齡范圍31-81歲,中位年齡53歲。卵巢癌患者與健康婦女的年齡無顯著性差異;與卵巢良性腫瘤患者的年齡有顯著性差異(p<0.05)。
2.271份標(biāo)本共使用10個96孔板。經(jīng)Crubbs氏法質(zhì)控檢驗,第1~9板符合質(zhì)控要求,第10板不符合質(zhì)控要求。舍棄板10數(shù)據(jù),共計26份標(biāo)本,包括卵巢良性腫瘤8例以及健康婦女18例。Kolmogorov-Smirnov檢驗對質(zhì)控品光密度進行正態(tài)性檢驗,三個濃度p值分別為0
8、.919,0.751,0.931,均符合正態(tài)分布。并去除標(biāo)準(zhǔn)曲線以外的極端大值6例和極端小值8例。
3.在臨床全部271份的血清樣本中均可以檢測到Annexin A3蛋白的表達。去掉極端值及質(zhì)控不合格值后,共有樣本231份進行統(tǒng)計分析。經(jīng)Kolmogorov-smirnov檢驗,卵巢良性腫瘤患者Annexin A3測定值為正態(tài)分布,p=0.387。健康婦女和卵巢癌患者Annexin A3非正態(tài)分布,P值分別為0.028,0
9、.007。在健康婦女血清中的
Annexin A3表達范圍在0.261-4.74ng/mL,平均值0.867ng/mL,中位數(shù)0.709ng/mL。卵巢良性腫瘤患者Annexin A3蛋白的表達范圍在0.263-2.46ng/mL,平均值0.815ng/mL,中位數(shù)0.740ng/mL。卵巢癌患者Annexin A3蛋白的表達范圍在0.201-2.84ng/mL,平均值0.689ng/mL,中位數(shù)0.567ng/mL。經(jīng)K
10、ruskal-Wallis檢驗,三組相比無顯著性差異。分析研究對象血清Annexin A3的表達水平與CA125測定值的相關(guān)性。將健康婦女血清CA125值分為<10U/mL和≥10U/mL兩組,Annexin A3的表達水平無明顯差別。將卵巢良性腫瘤患者血清CA125值分為<35U/mL和≥35U/mL兩組,Annexin A3的表達水平也無明顯差別。將卵巢癌患者血清CAl25值分為<100U/mL和≥100U/mL兩組,前者的Anne
11、xin A3的測定平均值為0.645 ng/mL,后者平均值為0.840 ng/mL,兩組的表達水平有顯著性差別(p=0.043)。
4.根據(jù)卵巢上皮癌患者末次化療的時間將研究對象分為化療敏感和耐藥兩組。按照患者的年齡、血清CA125水平、FIGO分期、腫瘤的病理學(xué)類型、分化程度、以及鉑化療的療程總數(shù)等生物學(xué)變量進行分層,兩組之間Annexin A3蛋白的表達水平均未達到統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差別。進一步根據(jù)卵巢癌患者末次鉑類化
12、療的時間統(tǒng)計無鉑化療間期,分為≤6個月和>6個月兩組,按照Annexin A3的表達水平的測定值分層,取所采用試劑盒建議的標(biāo)曲范圍最小值0.8ng/mL為上限,以0.2ng/mL為一個層間距,至試劑盒的最小分辨度為0.2ng/mL為下限,共分為4層。分析表明,伴隨分層Annexin A3基礎(chǔ)數(shù)值的遞增,兩組Annexin A3測定值的的平均值和中位數(shù)平行線性上升。至Annexin A3≥0.6ng/mL層時,兩個組Annexin A3表
13、達水平同步進入正態(tài)分布區(qū)間,采用t檢驗對兩組間的平均值進行比較。在Annexin A3≥0.6ng/mL層,Annexin A3的均值,無鉑化療間期≤6個月組為1.17±0.615ng/mL:>6個月組為0.924±0.250 ng/mL,p=0.048。在AnneixnA3≥0.8ng/mL層,AnnexinA3的均值,無鉑化療間隔≤6個月組為1.44±0.647ng/mL;>6個月組水平為1.07±0.214 ng/mL,p=0.0
14、28。由于兩組的方差齊性檢驗P值均<0.05,進一步采用t’檢驗,獲得對Annexin A3均值檢驗的P值,在Annexin A3≥0.6ng/mL層,p=0.095;在Annexin A3≥0.8ng/mL層,p=0.070;統(tǒng)計學(xué)十分接近顯著性差別。
結(jié)論:
1.本研究首次連續(xù)收集較大量的臨床標(biāo)本開展卵巢癌鉑類耐藥相關(guān)蛋白Annexin A3在人外周血中檢測的研究。共收集健康婦女102例,卵巢良性腫瘤患者
15、47例,卵巢癌患者122例,共計271例研究對象。
2.采用ELISA法可以完成對Annexin A3蛋白在人外周血清中表達的高通量定量檢測。在臨床全部271份的血清樣本中均檢測到Annexin A3蛋白的表達,健康婦女和卵巢癌患者Annexin A3非正態(tài)分布。有超過150例標(biāo)本的測定值低于建議標(biāo)曲范圍的最小值0.8ng/mL,表明現(xiàn)有ELISA試劑盒的敏感性欠佳。開發(fā)更加敏感的檢測方法可以完善對Annexin A3蛋白
16、在人外周血中檢測的研究。
3.現(xiàn)有樣本中,Annexin A3蛋白在健康女性、卵巢良性腫瘤患者和卵巢上皮癌患者外周血清中的表達無顯著性差異。Annexin A3蛋白的表達與健康女性和卵巢良性腫瘤患者外周血中CA125水平無明顯相關(guān)性;而與卵巢上皮癌患者外周血中高水平CA125的表達有關(guān),提示Annexin A3蛋白可能是卵巢癌特異性相關(guān)蛋白。本研究中卵巢癌患者Annexin A3蛋白的測定值在直觀上低于健康女性和卵巢良性腫
17、瘤患者,可能與前者均為術(shù)后化療或化療后隨訪的病例,其腫瘤負荷大大降低有關(guān)。檢測卵巢癌患者術(shù)前或化療前血清Annexin A3蛋白水平將有助于證明Annexin A3蛋白能否成為卵巢癌鉑類耐藥標(biāo)記蛋白。
4.本研究表明,根據(jù)卵巢上皮癌患者末次化療的時間將研究對象分為化療敏感和耐藥兩組,按照患者的年齡、血清CA125水平、FIGO分期、腫瘤的病理學(xué)類型、分化程度、以及鉑化療的療程總數(shù)等生物學(xué)變量進行分層,兩組之間Annexin
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