小樣本前瞻性檢測卵巢癌患者腫瘤組織和外周血中鉑類耐藥標(biāo)記蛋白annexin A3的表達(dá)及其相關(guān)耐藥機(jī)制的探討.pdf

1、卵巢癌是死亡率居首位的女性生殖道惡性腫瘤。經(jīng)過規(guī)范的理想腫瘤細(xì)胞減滅術(shù),輔助鉑類/紫杉醇為基礎(chǔ)的化療,仍有70％的患者面臨復(fù)發(fā)或疾病進(jìn)展,晚期患者的5年生存率不足40％。腫瘤細(xì)胞對于化療藥物產(chǎn)生耐藥性是影響患者預(yù)后的重要因素。研究卵巢癌鉑類耐藥的機(jī)制以及對鉑類耐藥進(jìn)行預(yù)測,對于指導(dǎo)患者的個(gè)體化治療和改善卵巢癌的預(yù)后具有重要意義。
　　 本課題組自2003年開始致力于卵巢癌鉑類耐藥相關(guān)標(biāo)記蛋白的研究。運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出鉑

2、類耐藥相關(guān)蛋白anneixn A3,并對其進(jìn)行了深入的研究。動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),annexin A3高表達(dá)細(xì)胞在順鉑作用后裸鼠中成瘤率明顯上升；在體外研究中,運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)annexin A3的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)annexinA3能夠降低細(xì)胞內(nèi)鉑含量及鉑-DNA結(jié)合量,annexin A3高表達(dá)的細(xì)胞對鉑類的耐藥性顯著增強(qiáng)；在卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清和和卵巢癌患者血清中可檢測到annexin A3蛋白的存在。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)annexin A3通過

3、外泌小體exosome的形式外分泌,并在外分泌過程中攜帶細(xì)胞內(nèi)的鉑流出從而使細(xì)胞對鉑類耐藥性增強(qiáng)。
　　 基于以上的研究結(jié)果,本研究側(cè)重基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。前瞻性的檢測卵巢癌患者腫瘤組織及外周血中annexin A3蛋白的表達(dá),研究不同表達(dá)水平與患者鉑類耐藥和預(yù)后的關(guān)系。同時(shí)對影響annexin A3表達(dá)和鉑類耐藥的可能機(jī)制進(jìn)行初步探索。
　　 方法:
　　 1、前瞻性連續(xù)收集2009年9月至2010年4月

4、期間在北京協(xié)和醫(yī)院行手術(shù)、術(shù)后輔助鉑類為基礎(chǔ)化療的初治上皮性卵巢癌患者,詳細(xì)記錄相關(guān)的臨床資料。收集患者腫瘤組織,同時(shí)順序收集患者治療過程中的外周血,用于檢測annexin A3蛋白的表達(dá)。隨訪患者的無進(jìn)展生存期和對鉑類藥物反應(yīng)性。
　　 2、采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測卵巢癌腫瘤組織中annexin A3蛋白的表達(dá)水平。通過組間比較及Logistic回歸方法分析不同表達(dá)水平對鉑類耐藥的影響；生存分析檢驗(yàn)annexin A3蛋白

5、的不同表達(dá)水平對患者無進(jìn)展生存期的影響。
　　 3、運(yùn)用ELISA方法檢測卵巢癌患者外周血中annexin A3蛋白的表達(dá)。觀察治療過程中外周血annexin A3的動態(tài)變化趨勢,卵巢癌腫瘤組織中annexin A3蛋白的表達(dá)與外周血中該蛋白表達(dá)的相關(guān)性,以及鉑類化療的敏感與耐藥患者血清中annexin A3表達(dá)的差別。
　　 4、采用手工顯微切割方法純化腫瘤組織,運(yùn)用甲基化特異性PCR(MSP)方法研究annexin

6、A3基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)。比較腫瘤組織中annexin A3低表達(dá)和高表達(dá)組患者甲基化水平有無差異,鉑類耐藥和鉑類敏感患者甲基化水平有無差異,探索啟動子區(qū)域DNA甲基化對annexin A3蛋白表達(dá)和鉑類耐藥的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、自2009年9月至2010年4月期間共納入初治卵巢上皮癌患者53例,中位隨訪時(shí)間為15個(gè)月(范圍4.4—20.2月)。4例患者失訪；17名患者疾病進(jìn)展,其中5名患者死亡。鉑類敏感

7、患者38(77.6％)名,鉑類耐藥患者11(22.4％)名。
　　 2、經(jīng)免疫組織化學(xué)染色的51例腫瘤標(biāo)本中,陰性表達(dá)者13(25.5％)例,弱陽性者為12(23.5％)例,中等陽性者為13(25.5％)例,強(qiáng)陽性者為13(25.5％)例。將陰性和弱陽性定義為低表達(dá),中等陽性和強(qiáng)陽性為高表達(dá)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,annexin A3的表達(dá)水平和病理類型、分化程度、手術(shù)病理分期均無相關(guān)性(P值分別為0.499、0.610、0.703)

8、。除外失訪患者,25例低表達(dá)患者中僅1(4％)例鉑類耐藥,22例高表達(dá)患者中10(45.4％)例耐藥,兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P=0.001)。Logistic回歸分析顯示高表達(dá)與低表達(dá)相比明顯增加鉑類耐藥的風(fēng)險(xiǎn),其OR=27.6(95可信區(qū)間為2.3-327.3)。生存分析顯示高表達(dá)組較低表達(dá)組的PFS明顯縮短,平均無進(jìn)展生存期分別為13.9±1.3月和18.2±0.8月(P=0.01)。經(jīng)多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析,annexin A3表

9、達(dá)明顯影響患者無進(jìn)展生存期,其RR=3.219(95％CI1.126-9.206)。
　　 3、健康女性和卵巢癌患者血清中均可檢測到annexin A3的表達(dá)。卵巢癌患者化療前濃度明顯高于健康女性(P＜0.001),濃度分別為0.325ng/ml(0.157-1.25ng/ml)和0.187ng/ml(0.058-0.323ng/ml)。腫瘤組織中高表達(dá)組患者化療前外周血中annexinA3濃度高于低表達(dá)組,濃度分別為0.373

10、ng/ml(0.157-1.25 ng/ml)和0.298ng/ml(0.174-0.576 ng/ml)；腫瘤組織中陽性表達(dá)組外周血表達(dá)水平也高于陰性組,濃度分別為0.367 ng/ml(0.157—1.25 ng/ml)和0.273ng/ml(0.174—0.576 ng/ml)。但由于樣本量小均未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平(P值為0.316和0.125)。
　　 卵巢癌患者化療前、化療中和化療后濃度分別為0.325ng/ml(0.1

11、57-1.25ng/ml)、0.178 ng/ml(0.014—0.327 ng/ml)和0.141 ng/ml(0.016—0.40 ng/ml),化療中和化療后濃度明顯降低(P＜0.001)。疾病進(jìn)展后表達(dá)再次上升為0.250 ng/ml(0.127-0.40ng/ml),明顯高于化療中和化療后(P=0.001)。鉑類敏感組具有相似的趨勢。而鉑類耐藥組化療中的濃度為0.148ng/ml(0.064-0.285ng/ml),停止化療后

12、升高至0.188ng/ml(0.028—0.337 ng/ml)。
　　 外周血中annexin A3蛋白的表達(dá)與CA125有正相關(guān)性,Pearson檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)為0.312,P＜0.001。CA125＞35U/ml組樣本annexin A3的濃度為0.270ng/ml(0.191-1.057ng/ml)顯著高于CA125≤35U/ml組的0.171ng/ml(0.094-0.233ng/ml),P＜0.001。
　　

13、4、運(yùn)用MSPPrimer分析軟件,發(fā)現(xiàn)在annexin A3基因啟動子區(qū)域存在甲基化位點(diǎn)。卵巢癌細(xì)胞系和腫瘤組織中annexin A3基因啟動子區(qū)域甲基化位點(diǎn)均為甲基化和未甲基化的混合狀態(tài)?；颊吣[瘤組織甲基化的中位水平為33.3％(5.1％-86.5％)。腫瘤組織annexin A3高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的甲基化程度分別為37.5％(6.1％-73.7％)和27.2％(5.1％-86.5％),兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.559)。鉑類敏

14、感和耐藥患者的中位甲基化程度分別為31.7％(6.1％-79.3％)和38％(5.1％-64.1％),兩組也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.86)。
　　 結(jié)論:
　　 1、卵巢癌腫瘤組織中annexin A3蛋白的表達(dá)水平與患者的鉑類耐藥及預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)組鉑類耐藥風(fēng)險(xiǎn)明顯高于低表達(dá)組患者。腫瘤組織中annexin A3表達(dá)水平影響患者的預(yù)后,高表達(dá)組患者的無進(jìn)展生存期較低表達(dá)組明顯縮短。提示腫瘤組織中annexin A3蛋

15、白的表達(dá)可能成為預(yù)測患者鉑類耐藥和影響預(yù)后的重要標(biāo)志物。
　　 2、卵巢癌患者和健康女性外周血中均可檢測到annexin A3蛋白的表達(dá),化療前卵巢癌患者外周血中annexin A3蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于健康女性。腫瘤組織中annexin A3高表達(dá)者,外周血中annexin A3的測定值亦有升高,但現(xiàn)有的樣本數(shù)尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。化療可以使外周血中annexin A3的濃度明顯進(jìn)行下降。化療結(jié)束后,鉑類敏感組的annexin A

16、3測定值仍能進(jìn)一步降低,而鉑類耐藥組的該數(shù)值不降反升。疾病進(jìn)展時(shí)annexin A3明顯升高。外周血中annexin A3的表達(dá)和CA125有正相關(guān)性,CA125＞35 U/ml的樣本中annexin A3的濃度高于CA125≤35 U/ml的樣本。上述結(jié)果對于繼續(xù)探討annexin A3成為預(yù)測卵巢癌鉑類耐藥標(biāo)記蛋白具有積極意義。有待建立和開發(fā)更為穩(wěn)定和敏感的、在外周血中檢測annexin A3蛋白的方法和試劑盒。
　　 3、