外周血中NK和Treg細胞的數目和功能變化對供精人工授精不良結局的影響.pdf

1、供精人工授精術（Artificial insemination with donor sperm，AID）作為治療男性因素引起的不孕癥的一線輔助生殖技術已在全球范圍內廣泛應用。但其周期妊娠率不足20％，分娩活產率不足13％，導致大多數接受AID治療的婦女經歷反復授精失敗、生化妊娠與胚胎停育或自然流產等不良結局，嚴重影響她們的身心健康，同時制約了AID的發(fā)展。目前AID不良結局發(fā)生的原因尚未完全明確。
　　 大量研究表明自然殺傷（

2、Nature killer，NK）細胞與調節(jié)性T（Regulatory T，Treg）細胞在正常妊娠的維持中發(fā)揮重要作用，其數目和/或功能失調與復發(fā)性流產、原發(fā)性不孕及子癇前期等生殖病理性疾病的發(fā)生密切相關。最新研究顯示，NK、Treg細胞還與體外受精技術（In-vitro fertilization，IVF）中胚胎反復植入失敗的發(fā)生有關。此外，某些NK與Treg細胞參數在生殖失敗人群中可用于預測下次妊娠結局。但二者在除IVF外其它輔助

3、生殖技術所致的生殖失敗，如AID不良結局中的研究尚未見報道。
　　 本研究通過比較發(fā)生了AID不良結局的婦女與正常生育婦女未孕期外周血NK、Treg細胞的數目與功能變化，探討NK與Treg細胞對AID不良結局發(fā)生的影響。此外，利用受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC曲線）評價NK與Treg細胞數目、功能參數對AID不良結局發(fā)生的預測能力，篩選最佳預測指標，確定

4、臨界值，從而為發(fā)生AID不良結局高危人群的早期篩查及臨床干預提供依據。
　　 第一部分供精人工授精不良結局婦女外周血中NK細胞數目和功能的變化
　　 目的：探討外周血中NK細胞亞群數目與NK細胞毒性（NK cell cytotoxicity，NKCC）的變化對AID不良結局的影響。
　　 方法：以75例AID不良結局婦女為病例組，其中，實施≥4次AID均失敗的對象25例（組Ⅰ），發(fā)生生化妊娠對象25例（組Ⅱ），實

5、施AID后妊娠12周內曾發(fā)生胚胎停止發(fā)育或自然流產對象25例（組Ⅲ），以20例成功生育一次的健康婦女為對照組。收集所有對象卵泡末期外周血，采用密度梯度離心法分離單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，一部分采用三色流式細胞技術檢測總淋巴細胞群中CD56+、CD56+CD16+與CD56+CD16-NK細胞亞群數目；另一部分與K562細胞共培養(yǎng)，采用雙色流式細胞技術檢測NKCC。

6、>　　 結果：與正常對照相比，組Ⅱ與組Ⅲ的CD56+NK細胞數目明顯增加（P＜0.05），AID不良結局各組CD56+CD16+NK細胞數目均顯著升高（P＜0.01），但CD56+CD16-NK細胞數目各組間無差異（P＞0.05）；AID不良結局各組NKCC較正常對照升高，其差異有統計學意義（P＜0.01）。
　　 結論：卵泡末期外周血NK細胞毒性表型數目增加、NKCC增強影響AID不良結局的發(fā)生。
　　 第二部分供精

7、人工授精不良結局婦女外周血中Treg細胞數目和功能的變化
　　 目的：探討外周血中Treg細胞數目與功能變化對AID不良結局的影響。
　　 方法：以60例AID不良結局婦女為病例組，其中，實施≥4次AID均失敗的對象20例（組Ⅰ），發(fā)生生化妊娠對象20例（組Ⅱ），實施AID后妊娠12周內曾發(fā)生胚胎停止發(fā)育或自然流產對象20例（組Ⅲ），以20例成功生育一次的健康婦女為正常對照。收集所有對象卵泡末期與黃體末期外周血，采用密度

8、梯度離心法分離PBMC，采用三色流式細胞技術檢測CD4+T細胞亞群中CD4+CD25+Treg細胞的數目和CD4+CD25+FOXP3+功能表型的百分比。
　　 結果：與正常對照相比，AID不良結局各組卵泡末期外周血CD4+細胞群中CD4+CD25+FOXP3+功能表型百分比均顯著減少（P＜0.01），而CD4+CD25+Treg細胞數目各組間的差異無統計學意義（P＞0.05）；卵泡末期Treg細胞數目與自身黃體末期相比，正常對

9、照組卵泡末期CD4+CD25+FOXP3+功能表型的百分比顯著升高（P＜0.01），而AID不良結局各組月經周期內Treg功能表型百分比的差異無統計學意義（P＞0.05），CD4+CD25+Treg細胞數目在病例組與對照組月經周期內的變化均無統計學意義（P＞0.05）。
　　 結論：卵泡末期外周血中Treg細胞功能表型百分比下降與AID不良結局的發(fā)生有關；AID不良結局各組卵泡末期Treg細胞功能下降可能與月經周期中Treg細胞

10、功能表型擴增峰的缺失相關。
　　 第三部分外周血中NK和Treg細胞參數對AID不良結局預測價值的研究
　　 目的：評價NK與Treg細胞數目、功能參數對AID不良結局的預測能力，篩選出最佳的預測指標，確定其臨界值。
　　 方法：基于前兩部分的研究結果，對與AID不良結局發(fā)生相關的CD56+、CD56+CD16+NK細胞數目、NKCC與CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞功能表型百分比進行ROC曲線分析，計

11、算曲線下面積（Area under curve，AUC）與曲線中各點對應的靈敏度與特異度，評價各參數對AID不良結局的預測價值。
　　 結果v CD56+、CD56+CD16+NK細胞數目、NKCC與CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞功能表型百分比的AUC分別為0.76，0.77，0.82與0.77；CD56+NK細胞數目＞16％，CD56+CD16+數目＞12％，NKCC＞10％與CD4+CD25+FOXP3+百分比＜