J-HNP-1多肽的重組及體外抗菌作用初步研究.pdf

1、條件致病菌感染病原菌多為耐藥菌，其主要來源于呼吸道、腸道、生殖道等粘膜表面，其感染常見于嚴重創(chuàng)傷、燒傷、移植術后、成人免疫缺陷綜合征等重癥患者。目前尚無良好的預防手段。粘膜上皮細胞有一個共同特點，即在細胞膜上具備多聚IgA受體(pIgR)。連有J鏈的IgA分子通過J鏈與pIgR結合后，將IgA分子轉運入粘膜細胞內。本研究擬將防御素改建為一種殺菌分子，分子的一端為J鏈，另一端為防御素，稱之為多聚IgA受體(pIgR)配體樣殺菌肽。這種殺菌

2、分子因連有J鏈，具有與pIgR結合的能力。從而利用pIgR作為橋梁，將防御素轉運至細胞內的微生物感染處發(fā)揮殺菌作用。本研究將HNP-1(屬α-防御素)與J鏈cDNA連接，然后在哺乳動物細胞系統(tǒng)中表達，并初步檢測其產物體外抗菌活性，為進一步研究其細胞內殺菌功能提供依據。 方法：應用PCR技術從不同的質粒中獲得J鏈基因和HNP-1基因，然后應用重組PCR技術將這兩個不同的基因連接在一起而成為J-HNP-1基因。將此基因克隆入哺乳動物

3、細胞表達載體pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中。用脂質體轉染法將此重組子導入COS-7細胞，分別從mRNA和蛋白質水平采用RT-PCR和Westernblot分析J-HNP-1的表達情況，并體外檢測細胞可溶性蛋白及培養(yǎng)上清的抗菌活性。 結果：1.利用重組PCR技術使J鏈與HNP-1這兩個不同的基因相連接而成為J-HNP-1重組體。 2.將J-HNP-1重組體克隆入哺乳動物表達載體pcDNA3.1(-)/Myc-H

4、isC質粒中，雙重標簽基因Myc和6×His位于下游，6×His起著檢測標志的作用，使J-HNP-1的表達產物易于檢測。 3.將重組質粒rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1應用正、反方向引物測序，檢測J-HNP-1的DNA序列及鑒定插入正反方向，獲得正向插入重組子。 4.RT-PCR結果顯示轉染rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1的COS-7細胞mRNA提取物中擴增出一條約78

5、6bp的片斷，其大小與預測相符合。采用WesternBlot印跡法，用抗His抗體檢測到轉染rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1的COS-7細胞的細胞可溶性蛋白及細胞培養(yǎng)上清(即細胞外泌蛋白)在約24KD處有一強反應條帶出現(xiàn)。 5.初步檢測轉染rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-136h后COS-7細胞的細胞可溶性蛋白及細胞培養(yǎng)上清(即細胞外泌蛋白)抑菌作用明顯。 結論：本研究重