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文檔簡介
1、目的:功能性消化不良是指具有上腹部疼痛、上腹部脹滿、早飽、噯氣、食欲不振、惡心、嘔吐等上腹部不適癥狀,經(jīng)檢查排除引起這些癥狀的器質(zhì)性疾病的一組臨床綜合癥。柴胡疏肝散是治療功能性消化不良的經(jīng)典古方。中藥復(fù)方的治療作用是多種成分共同作用的結(jié)果。本實驗的目的:①建立快速、簡單、靈敏的超高效液相色譜.光電二極管陣列(UPLC-PDA)測定方法,定量分析柴胡疏肝散湯劑中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮蕓香苷、柚皮苷、
2、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、甘草素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異甘草素和芒柄花素16種成分。②建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)定性測定功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散湯劑后血漿中成分阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯。③研究柴胡疏肝散,阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯對大鼠胃腸運動的影響,部分闡明柴胡疏肝散治療功能性消化不良的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。④建立超高效液相色譜法(UPLC-PDA)研究功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散后血漿中阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯的藥物動力學(xué)。
3、
方法:
第一章柴胡疏肝散湯劑中16種活性成分的定量分析。
采用UPLC-PDA法測定柴胡疏肝散湯劑中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、甘草素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異甘草素和芒柄花素16種成分的含量,繪制各個成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并對其最低檢測濃度、精密度、回收率、樣本穩(wěn)定性和重現(xiàn)性進行驗證。色譜柱:ACQUITY BEH
4、C18柱(2.1mm×50 mm,1.7μm),流動相:乙腈(A)-0.5%醋酸水(B),梯度洗脫,流速:0.5mL/min,柱溫:40℃,檢測波長:190-480nm。
第二章阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯在功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散湯劑后血漿中的定性分析。
招募功能性消化不良病人,予一次口服柴胡疏肝散湯劑后取血。血漿經(jīng)甲醇直接沉淀法去除蛋白質(zhì)后,采用LC-MS法對病人血漿中阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯進行分離分析,通
5、過電離子噴霧(ESI)法,以選擇離子反應(yīng)檢測(SRM)方式進行檢測,阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯離子通道m(xù)/z分別為194.8-177.0和261.1-243.0.采用Waters Xterra C18(150mm×2.1 mm,5μm)色譜柱,流動相為10 mmol·L-1甲酸胺-乙腈(40:60,v/v),流速為0.2 mL·min-1,進樣體積為20μL,柱溫為40℃,樣品室溫度為5℃。
第三章柴胡疏肝散及其成分阿魏酸和水合
6、橙皮內(nèi)酯促胃腸動力作用研究。
采用大鼠在體胃排空和腸推進方法研究柴胡疏肝散,阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯促胃腸動力作用;采用離體腸管實驗研究阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯對大鼠腸管收縮作用個影響。
第四章功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散后吸收入血的阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯藥物動力學(xué)研究。
用蛋白沉淀法預(yù)處理血樣,UPLC法同時測定7名功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散湯劑后13個時間點血漿樣本中阿魏酸與水合橙皮內(nèi)酯的血
7、藥濃度。應(yīng)用3P97藥動學(xué)分析軟件對血藥濃度.時間數(shù)據(jù)進行擬合。選用磺胺甲噁唑為內(nèi)標(biāo),阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯檢測波長分別為321 nm和324nm。
結(jié)果:
第一章柴胡疏肝散湯劑中16種活性成分的定量分析
(1)建立了一個簡單、快速和靈敏的能同時檢測柴胡疏肝散湯劑中16種成分的UPLC-PDA法。樣品分析時間:17.5 min,色譜圖中各成分的色譜峰分離完全,無雜峰干擾。16種成分在其線性檢測范圍
8、內(nèi)顯示出良好的線性回歸,r2>0.9992。該方法日內(nèi)、日間精密度良好,其相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)波動在1.87%-5.61%之間;胡疏肝散16種成分的加樣回收率良好,平均加樣回收率在96.13%-102.46%之間,RSD≤6.74%。柴胡疏肝散湯劑樣本在24小時內(nèi)穩(wěn)定性好,RSD波動在0.78%~2.98%。柴胡疏肝散湯劑重現(xiàn)性好,RSD波動于1.94%-5.36%。
(2)經(jīng)UPLC-PDA方法檢測后,柴胡疏肝散湯劑中沒
9、食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、甘草素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異甘草素和芒柄花素16種化學(xué)成分被定量分析。
第二章阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯在功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散湯劑后血漿中的定性分析。
通過研究阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯主要色譜峰的質(zhì)譜特征,功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散湯劑后血漿中阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯被成功檢出。
10、第三章柴胡疏肝散及其成分阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯促胃腸動力作用研究。
與鼠空白對照組相比,柴胡疏肝散湯劑(20 g/kg),阿魏酸(100mg/kg)和水合橙皮內(nèi)酯(14,28 mg/kg)能明顯增加大鼠的胃排空率和腸推進率,P<0.05。、與大鼠空白腸相比,阿魏酸(1001μmol/L)和水合橙皮內(nèi)酯(10μmol/L)能明顯增加大鼠空腸縱行肌和橫行肌肉的收縮,P<0.05,水合橙皮內(nèi)酯(30,100μmol/L)能顯著增加
11、大鼠空腸縱行肌和橫行肌肉的收縮,P<0.01.
第四章功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散后吸收入血的阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯藥物動力學(xué)研究。
功能性消化不良患者(7名)口服柴胡疏肝散湯劑后,血漿中阿魏酸與水合橙皮內(nèi)酯被檢測。在色譜圖上兩種化合物分離完全,未出現(xiàn)其他物質(zhì)干擾峰,保留時間分別為6.5 min和15.7min,內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑為8.0 min。阿魏酸與水合橙皮內(nèi)酯的回收率分別為95.35%~102.56%和
12、95.58%~102.09%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standarddeviation,RSD)分別小于2.81%和3.86%。用空白血清加標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,阿魏酸線性范圍為10~320 ng/ml,信噪比為3時最低檢測線為1.5 ng/ml,最低檢測濃度為5 ng/ml;水合橙皮內(nèi)酯范圍為7.5~720 ng/mL,最低檢測線為2.5ng/mL,最低檢測濃度7.5 ng/mL。阿魏酸與水合橙皮內(nèi)酯在功能性消化不良病人體內(nèi)的
13、代謝過程被擬合為二室模型,阿魏酸與水合橙皮內(nèi)酯分別在27.50 min和23.57 min時達到最大血藥濃度0.199 mg/L和0.371 mg/L,阿魏酸的消除半衰期和AUC分別為131.27min和14.835μg·min/mL,水合橙皮內(nèi)酯的消除半衰期和AUC分別為139.53 min和31.445μg·min/mL。
結(jié)論:
(1)用超高效液相色譜-光電二極管陣列(UPLC-PDA)法檢測柴胡疏肝散
14、中主要有效成分快速靈敏,準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定且重現(xiàn)性好。此方法可成功用于同時檢測柴胡疏肝散湯劑中16種目標(biāo)成分的含量。
(2)功能性消化不良病人口服柴胡疏肝散后血漿中阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯被的LC-MS法成功分離和定性。
(3)柴胡疏肝散及體內(nèi)吸收成分阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯均有明顯促胃腸動力的作用,阿魏酸和水合橙皮內(nèi)酯是柴胡疏肝散治療功能性消化不良的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。
(4)采用超高效液相色譜法對功能性消化不
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