隨機掃描光刺激系統(tǒng)研究.pdf

1、多細胞或多神經突起的選擇性激活對于研究神經元整合、神經元計算非常重要。近幾年,基因工程與光刺激技術結合,推動了一項新技術光遺傳技術的誕生,它可以快速、無損、精確地激活表達光敏感通道的細胞,進而選擇性地控制特定神經元或局部神經環(huán)路的活動。目前熒光顯微鏡使用的光源大都是寬場光源,進行光刺激時會把整個視場中的所有細胞或整個神經環(huán)路激活。激光掃描顯微鏡通過掃描鏡實現多細胞的選擇性激活,但由于掃描鏡內在的固有慣性,限制了掃描速度和多個位置的選取。

2、最近,空間光調制器被引入顯微鏡系統(tǒng)中實現了無慣性的選擇性激活,但其較低的刷新頻率和衍射效率限制了該技術的應用。相比而言,聲光偏轉器具有隨機尋址能力,能夠快速無慣性引導激光到任意位置,良好的空間選擇性使得聲光偏轉器非常適合多細胞選擇性激活。
　　為了實現以上目的,本文首先利用聲光偏轉器作為光束掃描器件,結合現代光學顯微鏡技術,建立了獨立的隨機光刺激系統(tǒng),相關的工作主要有:
　　(1)在光路結構設計中,采用二維聲光偏轉器實現激光

3、光束的二維掃描,并采用通用光學器件、光學調節(jié)架實現與顯微鏡系統(tǒng)耦合,實現生物樣品顯微放大、可視化處理,引導激光刺激期望的細胞或神經元;在機械設計中,采用模塊化設計思想,使得系統(tǒng)結構緊湊,方便與各種商用顯微鏡系統(tǒng)耦合;為控制聲光偏轉器工作,設計了驅動電路,它包括標準的數據采集卡、開關電源和控制電路,用于數據傳輸和與其它外設通信;基于LabVIEW應用軟件,開發(fā)一套獨立的應用控制軟件,擁有多種刺激模式,軟件可讀性好,操作方便。
　　(

4、2)測試了隨機光刺激系統(tǒng)的工作性能,單點最快時間可以達到10μs。在40倍物鏡下,刺激光斑為1.38μm,刺激范圍為164μm。光刺激功率波動<5％,刺激定位誤差小于1％。實驗結果證明系統(tǒng)具備多點快速激活的能力,系統(tǒng)工作穩(wěn)定,具有很好的重復性。
　　其次,為了分析測試系統(tǒng)的激活模式與激活效果以及開展生物學應用,與上海神經所的章曉輝研究員、王佐仁研究員兩課題組展開合作研究,主要的工作有:
　　(1)利用表達有光敏感通道的HEK

5、293細胞和海馬神經元,證明系統(tǒng)在10ms內可以激活細胞和誘導出動作電位。提出刺激光功率決定系統(tǒng)刺激的空間分辨率,并證明在一定的功率條件下,系統(tǒng)能夠激活單細胞而不會激活周圍其它細胞,顯示系統(tǒng)具備局部激活能力,而采用雙光子激發(fā)將能夠提高系統(tǒng)的空間分辨率,便于實現單細胞激活。分析了點刺激模式與區(qū)域刺激模式的不同,提出采用區(qū)域刺激模式可以顯著提高去極化峰值電流、動作電位的誘導頻率及誘導成功率。提出對于區(qū)域刺激模式,采用隨機掃描方式比順序掃描方

6、式和環(huán)形掃描方式更有效激活細胞。隨機光刺激系統(tǒng)能夠在微秒水平控制激光刺激多個位置,刺激時間、刺激間隔、刺激位置、刺激強度等可精準調控,是一種超靈活、多模式調控細胞或神經元的工具。
　　(2)利用隨機光刺激系統(tǒng),對小鼠體感皮層神經環(huán)路和果蠅嗅覺系統(tǒng)進行了光刺激試驗,證明系統(tǒng)適用于不同尺寸細胞的光刺激,系統(tǒng)可以選擇性激活多個細胞,可以模擬神經元多個信號輸入,進行神經元運算研究和信息整合研究,有利于揭示單個神經元和特定神經網絡的功能,證